昆虫基因工程
制作人：凌发忠

主要内容
以发育分子生物学研究模型及P元件转化为 特征的果蝇系统 以修饰改良物种及转座子转化为特征的蚊 虫和农业害虫系统 以表达异源功能蛋白及病毒转染为特征的 家蚕系统
6.1 果蝇的基因转化系统
6.1.1 果蝇转座元件 的结构及特征
Copia因子
FB家族 P元件
杆状病毒的表达载体系统
杆状病毒表达载体的常用四种启动子
1 多角体蛋白编码基因启动子（polh-P) 2 P10蛋白编码基因启动子（p10-P) 3 融合或修饰启动子（p39-P-Pn) 4 家蚕丝心蛋白编码基因启动子
BmNPV的表达系统的优点
1 在多角体蛋白编码基因的强启动子介导下，外源
果蝇转座元件P元件的结构与特征
结构
属于一个家族，含有31bp的末端反向重复序列。 转座时在靶DNA上产生8bp的正向重复序列，不同 的P元件所含有的开放阅读框数量不同。
特征
P元件转座能力的激活具有组织特异性，只发生 在生殖细胞中，但是P元件中转座酶的的编码序 列却是在生殖细胞中和体细胞中都能转录。
6.2.2 用于非果蝇类昆虫转化株筛选的遗传标记
颜色标记
色素基因：野生型基因突变所形成的等位基因影响眼睛色 素的合成
眼睛颜色标记，例如 地中海蝇的white基因等
存在的问题
尽管控制眼睛颜色基因的发现和鉴定有助于显性标记系统的 建立，但如果没有突变的宿主细胞怎么筛选？
显性筛选标记
1 化合物或药物抗性基因
实验证明，唾液腺和中肠结合肽（SM1）能强烈 抑制疟原虫横跨唾液腺和中肠上皮细胞。 Junitsu Ito等人构建一种驱动系统以表达能抑制 疟原虫发育的基因。
6.3 家蚕的基因表达系统
6.3.1 家蚕的分子生物学
基础工作
1 28条染色体，500kb的遗传连锁图谱 2 450Mb的全基因组 3 16948个完全基因和7285个基因片段 4 鉴定功能）的序列分析
典型基因
1 雄性特异性表达的基因 2 性别决定基因
6.2.3.2 条件致死型转基因株的构建
1 四环素抗性操纵子基因表达系统 特征：目的基因的表达取决于抗生素的存在与否、 转录激活因子的性质及其产生的调控机制 2 酵母Gal4-UAS二元基因表达系统
特征：Gal4能促进UAS下游的目的基因表达，若 UAS下游有适当的致死基因则可达到目的
P元件转录产物的剪切模式
体细胞内剪切模式
只有前两个内含子被切除， 形成一个ORF0-ORF1-ORF2的 编码区，获得66kD的蛋白质 是P元件转座活性的阻遏物
生殖细胞内剪切模式
把3个内含子全部切除，从 而连接4个阅读框，形成的 mRNA被翻译成87kD的转座酶， 可通过一种非复制型的方式 进行转座。
基因高效表达
2 对脊椎动物和其他昆虫是安全的 3 双链环状的病毒基因组结构易重组操作 4 修饰加工系统接近于哺乳动物 5 重组BmNPV分子可以在蚕体和细胞培养物内表达
6.3.3 家蚕生物反应器的构建
原理
BmNPV基因组是超螺旋的闭环双链DNA，多角体蛋 白基因不是病毒复制的必需基因，它在感染晚期高效表达， 其编码的多角体蛋白只起包埋病毒粒子的作用，与病毒的 感染没有直接的关系。 多角体蛋白基因即使部分或全部被外源基因取代，仍 能形成有感染性的病毒粒子，根据这一特性，将外源基因
P元件介导的基因转移操作程序
6.2 蚊虫和农业害虫的基因改造系统
害虫的治理
杀虫剂---------对环境造成不可逆的污染
转基因植物----食品安全性的担忧
分子遗传学家的设想
昆虫不育技术，“以虫治虫”
6.2.1 用于非果蝇类昆虫转化的载体
6.2.1.1用于 非果蝇类昆 虫转化的转 座元件
发育循环过程
6.3.2.2 杆状病毒的基因组结构
四类功能基因
1 结构蛋白编码基因 2 DNA复制及基因表达调 控基因 3 与宿主相互作用的基 因 4 酶蛋白基因
6.3.2.3 杆状病毒的基因表达调控
早早期，约感染0-3h,基因表达依赖宿主基因表达产物。 迟早期，约3-6h，基因启动依赖早早期基因产物，表达产 物包括病毒DNA复制所必需的蛋白。 晚期，约6-10h,DNA复制启动，同时合成BV装配所需的 结构蛋白，产生成熟的BV粒子。 晚晚期，约10h后，合成的蛋白是装配加工OV粒子并包 埋入包涵体所必需的。
抗病原体传播的转基因蚊虫至少 满足两个条件才具备实用价值：
1.具有与野生型同伴的交配竞争优势。 2.它们所携带的优良转基因能稳定有效地 垂直传递到子代。
6.2.4.2 疟疾蚊虫的基因工程
蚊虫是疟疾传播必需的媒介。
疟蚊从受感染的宿主吸血后，疟原虫的配子母细 胞转化成配子，后者交配后形成合子，再发育成 动合子。动合子横跨疟蚊的中肠上皮细胞时，疟 原虫在疟蚊中的发育过程全部结束。
通过基因操作技术替换BmNPV基因中的多角体蛋白基因，
从而使重组BmNPV在蚕体细胞内大量表达外源蛋白。
BmNPV系统表达外源基因示意图
操作流程 目的基因插入转移 载体。 目的基因转移到病 毒基因组靶位点， 空斑纯化获得重组 病毒。 重组病毒感染宿主 培养细胞或幼虫。
利用家蚕BmNPV载体表达的外源重组蛋白 人类胰岛素样生长因子Ⅱ 人和小鼠白细胞介素－３ 日本脑炎病毒膜蛋白gp120和gp41 艾滋病毒核心蛋白等等
2 绿色荧光蛋白（GFP）基因 3 改良的GFP标记系统
6.2.3 农业害虫的基因工程
目标
1 借助共生细菌或病毒
2 构建具有交配优势且能使害虫子代绝育的转基因株 3 构建在特定条件诱导下使子代自戕的害虫转基因株
6.2.3.1 分子绝育型转基因株构建的基因资源
原理
筛选可操作性靶基因，该基因可破坏害虫的生殖 系统或使害虫子代只产生单一性别的子代，进而 表现不可发育的遗传表型。
6.1.3 P元件介导的果蝇经典转化程序
经典实验的验证
1982年，A.C.Spradling和G.M.Rubin,证实若质 粒含有P元件，将该质粒注射到果蝇M型雌性果蝇 的胚胎中，可实现基因转移。
P元件介导的果蝇转化条件 1 受体细胞内存在转座酶 2 存在反向重复序列及其邻近的亚末端序列
家蚕表达系统难以产业化原因
主要原因： 无论是重组家蚕细胞培养物还是转基因幼 虫，一般都会在病毒感染后的4-5天内裂解 死亡，导致外源基因活性产物的表达时间 比较短，难于组织规模化生产。 克服困难的关键是建立一套重组家蚕细胞 的连续培养系统。
Minos
Hermes mosl piggyBac
转座方式的不利因素 1 昆虫物种有限 2 产卵数量有限 3 卵细胞难以渗透
思考： 如何得到基因传播速度快，有且只有在昆虫体细胞 中表达的转化载体？
6.2.1.2 用于非果蝇类昆虫转染的病毒
1 昆虫逆转录病毒 例如：gypsy具有感染和转座双重性，一般转座 效率高于转染效率 2 浓核病毒
3 温度敏感型致死系统 特征：携带温度敏感型致死基因的个体在18摄氏 度时被冻死
四环素抗性操纵子基因表达系统
6.2.4 蚊虫的基因工程
6.2.4.1 蚊虫转基因技术的基本战略
进展
蚊虫转化的主要研究焦点是再生能抗疾病传播的蚊子。 实验发现，有些蚊虫包裹从中肠上皮细胞进入血管内腔的 疟原虫的能力增加，进而确定蚊虫免疫系统中某些基因可 作为构建抗病原体转基因蚊的靶基因。 目前，利用转基因技术构建阻断病原体传播的转基因蚊虫 取得了重要的进展。 例如：含有登革热病毒包衣蛋白反义基因的SIN病毒能导 致受感染的蚊虫体内登革热病毒颗粒显著减少。
6.3.2 基于杆状病毒的家蚕基因表达系统
杆状病毒的生物学特征
1 宿主只限于无脊椎动物，主要是昆虫纲的7个目 2 包涵体杆状病毒重要科属包括NPV（核型多角 体病毒）和GV（颗粒体病毒），GV比NPV小 3 NPV的病毒颗粒在多角体里的数目不同分为单 粒包埋型病毒和多粒包埋型病毒 4 杆状病毒的发育循环含有两个独特的时期。即 BV（出芽型病毒）和OV（包埋型病毒）
既可感染控制害虫，又可作为外源基因的运载工 具，但感染的宿主范围比较窄 3 新培斯RNA病毒
可高效感染蚊子成虫细胞，且支持RNA高效转录 及蛋白质合成
6.2.1.3 用于非果蝇类昆虫转染的共生生物
共生转基因技术：利用合适的共生生物在昆虫 中表达外源基因。
1.节肢动物体内的Wolbachia（沃尔巴克氏体） 当感染力Wolbachia的雄性昆虫与非感染型的雌性 昆虫交配后，其子代具有不育或部分不育特征；而受 感染的雌性昆虫与任何性质的雄性昆虫交配，其子代 具有生育力。因此，受感染的雌性昆虫具有独有的繁 殖优势。 试想带有某种有益特征的Wolbachia去感染少数昆 虫，便可将有益特征迅速传播到整个昆虫种群。 但目前还缺少有效地转化程序。 2.寄生在接吻臭虫（Rhodnius prolixus）体内的 Rhodococcus rhodnii
6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育
果蝇中有一种遗传学 现象：
• P品系雄果蝇与M 品系雌果蝇杂交后 代不育。 • M或P品系雄果蝇 与P品系雌果蝇杂 交后代可育。
转座子在此过程中的作用
• P元件（P element）存在于P品系黑腹果蝇中，而M 品系中缺乏。 • 当P雄性与M雌性杂交时， P元件在其杂交后代的性细 胞中被激活，从而产生了编码转座酶的序列。 • P元件也产生转座的阻抑物，它是雌蝇细胞质遗传。P 型雌蝇细胞质遗传产生转座阻抑物，阻止了P元件的 转座。