单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。
方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。
显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。
结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。
尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。
结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。
关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。
慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。
DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。
单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。
鉴于此，本研究以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提供研究基础。
1. 材料与方法1.1 试剂MnCl2·4H2O(购自上海生化试剂公司, AR级), Dulbcco's Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及新生小牛血清购自Gibco公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PL YS)购自生物工程产品公司（上海）.低熔点凝胶(LMPA)及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分析纯级1.2 皮层神经元的原代培养制备原代皮层神经元方法参照方法所述[1]. 取新生24小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s液的玻璃瓶，机械法分离神经细胞。
200um稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液800转/分离心51本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号：30260095）的资助。
分钟，弃上清，重悬细胞并离心，重复3次。
最后，以含15%新生小牛血清的DMEM调整细胞密度为1×105 /ml，接种于24孔板内的圆玻片上，玻片提前用多聚赖氨酸包被（隔夜），细胞培养于37°C、5% CO2培养箱。
3-5天后加入阿糖胞苷(Ara C, 10-5mol/l)以抑制非神经细胞增殖。
1.3 尼氏染色确认培养物即是所需神经细胞，采用传统的的尼氏染色法，步骤如下。
镊子夹出孔板中的圆玻片，PBS小心洗掉培养液并用中性福尔马林液固定30分钟。
PBS冲洗，1%甲苯胺蓝染色3分钟，去离子水冲洗后乙醇纠正色差，脱水后于光学显微镜下观察。
1.4 细胞分组培养7-9天，神经细胞达最佳生长状况后即开始试验。
根据神经细胞与含锰的DMEM 孵育与否，将细胞分对照组与锰处理组。
后者包括低、中、高三个浓度锰组，根据本室前期的研究结果，锰的浓度分别设为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L ，对照组为正常培养的神经细胞。
各组干预24小时后终止处理。
1.5 单细胞凝胶电泳单细胞凝胶电泳（SCGE或彗星试验）参照Sigh等人的方法[2]并稍作改动。
冰冻的载玻片覆盖100ul1%的低熔点凝胶并储存于4°C，15分钟直到胶凝结。
细胞与0.6%正常熔点凝胶的混合物铺做第二层并置4°C，15分钟直至凝固。
此后载玻片浸入新鲜制备的、预冷的裂解液中裂解90分钟。
之后，载玻片平放于电泳槽电泳（电泳条件为200mA,20V,30min），再以中性缓冲液淋洗载玻片，10ug/ml EB染色后在配有数码相机的病理图像分析仪下观察、分析。
整个试验操作在暗室中进行，以免造成DNA额外的、人为的损伤。
以计数的100个细胞中彗星样细胞出现率及彗星尾长为评价DNA损伤程度的指标(200×)。
1.6 统计分析所有数据以均数（M）±标准差(S.D)表示，单因素方差（ANOV A）比较各组均数的统计学差异，行×列比较各组百分率的构成差异，统计学差异水平设为5%。
2. 结果2.1 体外的皮层神经细胞体外的神经细胞在24小时内黏附于孔板底的圆玻片，头3天生长迅速。
阿糖胞苷加入后抑制了非神经细胞的增殖，神经细胞轮廓清晰，以多型胞体,突起粗大，核浆比例大为特征，神经元间在体外形成神经网络。
(图1)Figure 1Fig1 400×成熟的皮层神经元，胞体多形，突起粗大、光滑，核浆比例大，相互间形成神经网络。
Figure 2Fig2 400× 示核及丰富的尼氏小体，神经元胞浆中核及尼氏小体经甲苯胺蓝染色后显蓝紫色。
图1--2 体外正常培养的神经细胞及其鉴定（尼氏染色）2.2 神经元的尼氏染色皮层神经元胞浆中具有大量的尼氏小体，与碱性甲苯胺蓝有强大的亲和力而被染成蓝紫色，胞浆中央往往有一至两个核仁，但非神经胶质细胞则没有这些特征。
（图2）2.3 锰干预后神经细胞的形态学改变皮层神经元经不同浓度锰处理24小时后，镜下可见明显的形态学损伤变化，正常的神经网络遭破坏，神经皱缩或肿胀成一小球，并随着锰浓度的增加的加剧。
仍贴壁的神经元则轮廓模糊，间断的神经突起呈串珠样改变。
（图3—6)Fig3 200× normal controlFig4 200× 0.2 mM MnCl2Fig5 200× 0.6 mM MnCl2Fig6 200× 1.0 mM MnCl2图3—6不同浓度锰干预后神经细胞的形态学改变2.4 锰暴露后神经细胞DNA的损伤正常培养情况下，对照组神经细胞有少量具短小尾巴的彗星样神经细胞，表明神经元DNA 有轻微损伤。
染锰后，相比对照组而言，彗星细胞尾长增加，彗星样神经元百分率升高，且随着染锰浓度的增加，彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率增加，两者呈同样变化趋势，表明DNA损伤加重。
见Fig7~Fig10及Tab1。
Fig7 ControlFig8 0.2mM-MnCl2Fig9 0.6mM-MnCl2Fig10 1.0mM-MnCl2图7—10不同浓度锰暴露后神经细胞DNA的损伤：表1:锰对皮层神经细胞DNA损伤的影响分组浓度（mM）细胞数彗星样细胞彗尾长度（X±S,um）彗星样细胞百分率%对照组— 100 15 84.1±11.8 150.2 100 40 117.3±30.8☆★ 40☆★0.6 100 43 136.6±29.0☆★ 43☆★锰处理组1.0 100 96 218.7±22.6☆◇ 96☆◇注：☆ P＜0.01,与对照组相比；◇ P＜0.01,与 0.2mM MnCl2相比；▲ P＜0.01,与0.6mM MnCl2相比；★ P ＜0.01,与1.0mMMnCl2相比。
T检验、X2证实各组神经元彗星尾长、彗星样细胞百分比均存在统计学差异，两指标的变化趋势一致。
MnCl2处理组彗星尾长、彗星样细胞百分比高于空白对照组(P＜0.01)。
1.0mM MnCl2 组彗星尾长、彗星样细胞百分比明显高于0.2mM MnCl2 and 0.6mM MnCl2 组 (P＜0.01)。
但彗星尾长、彗星样细胞百分比在0.2mM MnCl2 and 0.6mM MnCl2 组间无明显差异(P＞0.05)。
3. 讨论DNA损伤的原因包括自发性的化学损伤及其他多种理化因素如紫外线照射、放射、氧化剂等。
DNA损伤表现形式多样化，如DNA链断裂、氧化损伤、DNA加合物、链间的交叉联结、化合物与DNA的共价结合，DNA的合成抑制及的非程序性DNA修复合成等（UDS）[3]，是化学致癌过程中早期可检测到的关键步骤。
锰是人体必需的微量元素之一，位于多种金属酶的活性中心，亦是某些重要酶的活化剂，参与蛋白质、DNA、RNA等生命大分子物质的合成，过量锰负荷则对这些大分子产生负性影响。
谭湘凌发现，一定浓度下锰对遗传物质有抗癌作用，但浓度较高时失去此作用[4]。
曹晓非等观察了人外周血淋巴细胞对11种金属诱发的UDS结果，发现Mn在高浓度时(1.0mmol/L)才损伤细胞DNA[5]。
本试验的离体细胞模型发现，神经细胞对各浓度锰均较敏感，神经元除了外在的形态损伤外，进一步的彗星试验可检测到各染锰组彗星尾长、彗星样细胞百分率的明显增加，尤以高浓度锰组显著，损伤程度远较中低组严重。
这种剂量依赖性与锰损伤其他细胞遗传物质的研究结果较为一致[6、7、8]。
既往的研究资料证实锰对遗传物质损伤的焦点在其产生的氧化应激[9]。
Mn2+存在可催化体内多巴胺、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类神经递质的自动氧化，生成O-2．、OH[10]．；另外Mn可与H2O2发生Fenton反应生成OH．，后者攻击DNA分子，直接损伤DNA；生成的OH.还影响DNA修复酶而导致DNA修复受限，这可能是Mn损伤DNA的重要机制[11]。
除此之外还有报道认为Mn2+直接损伤DNA，高浓度的Mn2+降低DNA稳定性[12]及致碱基损伤或DNA戊糖环断裂； Beckman[13]则认为，Mn致碱基配对发生错误，改变DNA聚合酶的特异性。
但锰致神经细胞DNA损伤的确切机制有待进一步研究。
本研究也表明，采用SCGE可在较短时间内灵敏地检测较低水平的单个细胞DNA损伤，可考虑将之推广用于锰中毒病人或其他遗传毒性物质的筛查，以便做到疾病的早发现、期预防、早治疗。