菌株非常重要。
基化缺陷
och 外侧糖链添加缺陷
型
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减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
LLyyss
靶蛋白
Lys
靶蛋白
Lys
Ubiquitin 76 aa Ubiquitin ligase E3
Ubiquitin ligase E3
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蛋白酶体
• 如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依 赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种 降解作用减少到最低程度：
构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片 段的外源DNA，这是构建YAC载体的基本思 路 • YAC载体的装载量酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。
5. 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
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酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，
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在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决 定：
• 第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷贝 均分给母细胞和子细胞.
• 第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少 时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷贝 数水平。
• 上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切 相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得高 拷贝的主要机制。
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2u质粒
• 几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个 6318bp大小的野生型2u双链环状质粒，它在 宿主细胞核内的拷贝数可维持在50-100之间， 呈核小体结构，其复制的控制模式与染色体 DNA完全相同。2u质粒上含有两个相互分开 的599bp长反向重复序列(IRs)，两者在某种 条件下可发生同源重组，形成两种不同的形 态(A和B)。
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• 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。 同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。 这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组， 它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗 传。
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• 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着 丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb 的序列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母 中的行为类似一微型染色体，它可以稳定 遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时 在宿主细胞中的拷贝数很低。
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酵母菌种的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线性质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链 线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个， 分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素 蛋白基因。
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• 酵母菌的载体系统分为三种： 质粒载体 整合载体（integrating vector） 人工染色体
含有CEN的YCp质粒的构建 • CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分
配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中， 获得的新载体称为YCp。 • YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷 贝数通常只有1-5个。
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酵母菌克隆表达质粒的构建
含有TEL的YAC质粒的构建 • 利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件
毕赤酵母属
如巴斯德毕赤酵母
裂殖酵母属
如非洲酒裂殖酵母
汉逊酵母属
如多态汉逊酵母
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研 究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基 因最理想
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提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变
突变 产生的异源蛋白
增加产量（倍数）
作用位点
SSC1
SSC2
GRAS） 酵母菌是最简单精品的课件真核模式生物
酵母基因组特征
与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基 因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp, 编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生 物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以 作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。 这就克服了在其它真核生物中隐性基因控 制的形状难以检测的缺陷。
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酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
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广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母
多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
7. 缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要
人工修正。
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酵母菌的基因工程
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酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序 列和标记基因，
构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定 序列中，这样目的基因就能高效
整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。
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酵母菌克隆表达质粒的构建
• 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变 株作为外源基因表达的受体细胞;
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• 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛 蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长， 但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株 低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因 表达受体。
• 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基 因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测 不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编 码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突变 株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却可 减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。此 外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源蛋 白稳定表达宿主系统的选择方案，
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• 该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、REP2 和D．其中FLP基因的编码产物催化两个IRS 序列之间的同源重组，使质粒在A与B两种 形态中转化，REP1、REP2和D基因均为控制 质粒稳定性的反式作用因子编码基因．上 述基因共转录出7种不同分子量的mRNA分子。
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• 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的 自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界 上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白因子 的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂时的 均匀分配起着重要作用，FRT存在于两个 IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白的识 别位点。
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减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。
UBA1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等 位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋 白降解。
• 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异 源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速 被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用;
• 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的 启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表 达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白 因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失;
rgrl osel NDS
ss1l
rho
凝乳酶原
牛牛生长因子
鼠α—淀粉酶
5-10
β—内啡肽
7-12
人血清蛋白
溶酶原活化剂抑制因子2型 10
α1 —抗胰蛋白酶P
人溶菌酶
10
人溶菌酶
10
人表皮因子
NDE
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Ca2+-ATPase 转录后 转录后
转录后 转录后
转录
羧肽酶Y 转录
酵母质粒载体又分为： 酵母附加型质粒(yeast episomal plasmid,YEp) 酵母复制型质粒(yeast replicating
plasmid,YRp) 酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid,YEp)
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• 酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存 在于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特 点是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分 为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子
酵母基因表达体系
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发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数 酿酒酵母中存在质粒。
2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。
3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。
• 但是，含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十 分缓慢，而且细胞的生存能力下降。
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• 整合载体：不含酵母的自主复制序列，因而不
能在酵母中独立复制的一种载体。这种载体必须 在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因 得到稳定表达。
• 在啤酒酵母中含有30～40个拷贝的可转移的遗传 因子(Ty),其结构包括两个长OFR和两个长末端重 复序列(LTR) , Ty可以整合到宿主细胞的染色体 上。如果在Ty的OFR2的3端与LTR的3端之间插入外 源基因，外源基因就可以随Ty一起整合到酵母染 色体上。