? 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异 源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速 被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用 ;
? 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的 启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表 达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白 因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失 ;
GRAS ） 酵母菌是最简单的真核模式生物
4
酵母基因组特征
与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基因组很小，仅有 16条染色体，含1.4X107 bp,编码约5000个蛋白质，是目 前已知真核生物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以作 为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。这就克服了在其 它真核生物中隐性基因控制的形状难以检测的缺陷。
优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工
修正。
3
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心 和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完 突变类型
整的糖基化系统，但野
生物效应
生型酿酒酵母对异源蛋
白的糖基化反应很难控 mnn 甘露糖生物合成缺陷型
制，呈超糖基化倾向， alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷
rgr l osel NDS
ss1l
rho
凝乳酶原
牛生长因子
3-10
凝乳酶原
牛生长因子
鼠α—淀粉酶
5-10
β—内啡肽
7-12
人血清蛋白
溶酶原活化剂抑制因子2型 10
α1 —抗胰蛋白酶P
人溶菌酶
10Leabharlann 人溶菌酶10人表皮因子
NDE
Ca2+-ATPase 转录后 转录后
转录后 转录后
转录
羧肽酶Y 转录
8
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母
裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母
汉逊酵母属 如多态汉逊酵母
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯 德毕赤酵母表达外源基因最理想
7
提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变
突变 产生的异源蛋白
增加产量（倍数）
作用位点
SSC1
SSC2
Ubc4-ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
13
酵母菌的载体系统
载体的一般结构
选择标记
复制子
表达盒
启动子
先导序列
终止子
有用的蛋白结构域
1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
14
酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列600bp， 重组FLP编码产物驱动Irs 的同源重组REP编码产物 控制质粒的稳定性STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSRI、 pSR1、pSB2和pSR1以 及克鲁维酵母属中的 pKD1质粒等，均有类似 的结构。
5
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
6
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母
因此超糖基化缺陷菌株 och 外侧糖链添加缺陷型
非常重要。
9
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
LLyyss
靶蛋白
Lys
靶蛋白
Lys
Ubiquitin 76 aa Ubiquitin ligase E3
Ubiquitin ligase E3
蛋白酶体
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? 如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依 赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种 降解作用减少到最低程度：
4. 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。
5. 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
2
酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展
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减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 UBI4基因表达， UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此 UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的 受体。
UBA1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶 E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。
? 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变 株作为外源基因表达的受体细胞 ;
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? 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛 蛋白基因 UBI4 的表达， UBI4突变株能正常生长， 但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株 低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因 表达受体。
? 编码泛蛋白激活酶 E1的基因也可作为突变的靶基 因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测 不出泛蛋白 -外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编 码E1蛋白的基因 UBA1是一种看家基因， UBA1突 变株是致死性的，但编码 UBA1 蛋白等位突变株却 可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。 此外，上述 6个UBC基因的突变也是构建重组异源 蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 FDA 认定为安全
基因工程受体系统（ Generally Recognized As Safe
酵母基因表达体系
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发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数 酿酒酵母中存在质粒。
2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的 leu 2基 因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的 Leu2缺 陷，标志着酵母表达系统的建立。
3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。