C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
Biochem. 118:825-831
在基因工程表达调控水平上，巴斯德毕 赤酵母（Pichia pastoris）基因表达系统 已有许多新进展。
Rodriguez, et al (1994) Paifer, er al (1994)
Kunitz protease inhibitor 1 S/Mut+ (APLP-2)
Van Nostrand, et al (1994)
thrombomodulin 0.01-0.03 S/MutS White, et al (1994)
Arch. of Bioch.&
Biophy 326:81-14
Human Clusterin, with native 0.1 S/n.r Lakins, et al (1995), J.
signal sequence(10-100 times
of Cellular Biochem
higher than S.cerevisiae)
6434
S/n.r Vad, et al (1995),
Yeast 11:S606
S/MutS Roca,
et
al
(1995),Yeast
11:S589
I/n.r Shiraishi, et al (1995),
Plant
Physiology
108:2(s) 72
I/MutS Trant, J.M. (1996),
短短十多年来，用该系统表达的外源基 因已达三百多种，表达的产物包括细胞 因子、基因工程疫苗、基因工程抗体、 蛋白酶及受体等，表1为利用毕赤酵母表 达的活性蛋白，其中大部分可成为医药 制品，用发酵罐发酵规模可达20-50M3以 上。因此，毕赤酵母表达系统的研究进 展具有极重要的经济效益和社会意义。
I/MutS
Vozza, et al, (1996), biotechnology 14:7781 Weib, et al (1995), FEBS 377:451-456
Staab, et al (1996), J
of
Biol.Chem.
271:6298-6305
Brandes, et al (1996),J
Tus
protein expression in Pichia pastoris
Protein
Expression
level(g/L)
Hepatitis B 0.4
surface
antigen
Beta-
20,000(U/mg
Scorer, et al (1993)
Carboxypeptidase B
0.8 S/Mut+ and MutS Despreaux, et al (1993)
TAP(tick anticoagulant 1.7
protein)
Porcine
leukocyte n.r
lipoxygenase (72kD)
目前用于基因表达的酵母表达 系统主要类型有以下11种：
酿酒酵母表达系统 粟酒裂殖酵母表达系统 克鲁维酵母表达系统 毕赤酵母表达系统 汉逊酵母表达系统 解脂耶鲁酵母表达系统
假丝酵母表达系统 许旺酵母表达系统 嗜腺嘌呤阿祖鲁酵母表达系统 丝孢酵母表达系统 球拟酵母表达系统
酵母菌基因工程载体：
载体类型的发展：毕赤酵母载体一般为穿 梭载体(Shutt1e Vector)，通常具有甲醇精确 诱导调控的醇氧化酶(Alcohol Oxidase ,AOX) 启动子PAOX；根据酵母菌基因组上 AOX结 构基因被外源基因所替换情况，形成Mut+ 或Mut-等不同表型；载体含有一个多克隆位 点、AOX1转录终止序列、酵母选择标志 His4以及来自大肠杆菌质粒 pBR322的Amp 和ColE ori序列等。
酵母附加体型载体(YEp) 酵母复制型载体(YRp) 酵母着丝粒型载体(YCp) 酵母线性载体(YLp) 酵母整合载体(YIp) 酵母人工染色体(YAC)
酵母复制起点：2μori ; ARS 酵母来源 DNA 酵母调控元件：AOX1; GAP
酵母选择标记：Trp1; Leu2; Ura3; His4 酵母载体
S/Mut+ and Muts
I and S/Mut+
Clare, et al (1991a) Romanos, et al (1991) Clare, et al (1991b) Vedvick, et al (1991) Wagner, et al (1992)
Barr, et al (1992)
外源基因在酵母体系中的表达
外源基因在酵母体系中的表达
酵母菌是一种单细胞真核生物，人们对其 遗传学、生理学和全基因组序列等方面已有 较为深入的研究。酵母菌在分类学上属于真 菌界子囊菌纲和担子菌纲，目前已发现90多 个属，700多个种，10000多个独立菌株，构 成一个庞大的微生物家族。
酵母作为基因工程表达系统，既有原核生物 那样生长、繁殖快速，表达量高的特点，又 有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后 加工和基因表达调控的特征。另一方面，长 期以来酵母作为工业微生物的主要菌种，在 工业化发酵方面已积累了大量的经验。因此 酵母表达系统是一种有着非常大的发展潜力 的真核生物基因表达系统。
S/MutS n.r n.r S/MutS S/MutS S/MutS
Ridder, er al (1995)
Jenkins and Fayer (1995) Howard and Maurer (1995) Steinlein, et al (1995) Ohsawa, et al (1995)
Fryxell, et al (1995)
S/Mut+ I/n.r.
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Tetanus toxin 12
of
Biol.Chem.
271:6490-6496
Human
MCP- 0.00
3(Monocyte
1
Chemotactic Protein)
Human erythropoietin 0.00
receptor
5
Angiotensin-conventing n.r
enzyme(90kD,active)
galactosidase total protein)
Invertase
2.3
Tumor
10
nectosis
factor(TNF)
Bovine
0.55
lysozyme c2
Streptokinase 0.08
(active)
Where/how expressed* I/Muts
I/Mut+ S/Mut+ I/Muts
Rabbit
scFv >0.1g/L
(30kD)
CP15(Cryptospori n.r
dium parvum)
Rat pit-1
n.r
Human N-terminal 0.27 transferrin Amyloid precursor 0.001-0.004 protein Human CD38 ~0.16
activity)
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S/MutS Sadhukhan, et al
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J
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