单细胞凝胶电泳技术的操作步骤
1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min 2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000 个细胞的0.6％低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固 化10min； 3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％ DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h； 4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电 泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。 5.电泳：电压20V，300mA，30min 6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min； 7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。或者4℃，潮湿，闭光 的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
光镜免疫金银细胞化学 原理示意图
பைடு நூலகம்
（一）水解酶 水解酶可分为五类即磷酸酶类、脂酶类、芳香基硫酸酯酶类、 糖苷酶类以及作用于肽键酶类。水解酶是催化水解的酶类，在超微结构水 平上显示酶的细胞化学方法都是以孵育阶段为中心，孵育液中一般都有酶 的反应底物和捕捉剂，反应的基本原理可分为两个步骤：1底物经过酶的 分解形成初级反应产物；2 初级反应产物和相应的捕捉剂形成一种不溶性 的化合物称为最终反应产物，这些最终反应产物是一些不溶性重金属沉淀 物（如铅、铜、钡等），在电镜下容易被检出。一般来说这些沉淀物在细 胞的位置就代表了酶促反应的位置。（二）氧化还原酶 氧化还原酶可分为 （ 氧化酶和脱氢酶两种。在氧化酶细胞化学反应中含有两个即分开又紧密联 系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是 四盐酸3，3’二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列的化学 变化生成强嗜锇性的聚合物，在经锇酸固定就形成了锇黑。脱氢酶常用在 捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存 在下进一步形成高度不溶的亚铁氰化铜沉淀。 。
在疾病防治方面:建立正常和病理的虚拟细胞模型,不仅可以虚拟细 胞的发生、活动和调节的生理机制,而且可以了解和揭示疾病发病过 程,寻找到致病分子和标记分子,进行疾病的预警诊断,提出防治和干 预措施,设计和试验新药物,建立新的医疗保健模式———“电子医 生”,发展新的生物高技术产业。 在社会公共卫生方面：通过虚拟细胞可以模拟营养、药物、毒物对 细胞的作用,因此可以作为医学营养学和食品卫生学研究的辅助手段, 代替一些危险的临床实验,发现对人体有利或有害的物质,避免对人 和生物的直接作用所产生的不良后果。虚拟细胞作为一个多能的仿 生环境,可以用于观察环境因素对人体的影响及其作用途径,提出防 治措施。另外虚拟细胞还可以作为一种多媒体教学手段,用于生物学、 医学等相关学科的教学方面,可以更直观、生动地重现细胞生命活动 的各环节,极大地提高教学的效率和效果
膜片钳技术原理
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平 方微米的细胞膜通过负电吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高 阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上 隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为 敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离 子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学 科学特别是神经科学是一资有重大 意义的变革。这是一种以记录通过 离子通的离子电流来反映细胞膜单 一的（或多个的离子通道分子活动 的技术。此技术的出现自然将细胞 水平和分子水平的生理学研究联系 在一起，同时又将神经科学的不同 分野必然地融汇在一起，改变了既 往各个分野互不联系、互不渗透， 阻碍人们全面认识能力的弊端。
一、膜片钳技术(patch clamp recording technique )
1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术 （ patch clamp recording technique ）。这是一种以记录通过离子通道 的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它 和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨 大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与 医学奖。
凝胶电泳的装置
三、电镜酶细胞化学技术（ enzyme cytochemistry technique ） 电镜酶细胞化学技术（
酶存在的特定位置称为酶的定位，酶的细胞化学技术就是通过酶的特 异性细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位，对于酶的细胞化学来说，酶 的特异性是很重要的。电镜酶化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起 来的新的一门技术，到目前为止，能在电镜下定位的酶有100多种，主要 通过酶的活性作用结果间接的证明酶的存在。一般先将酶固定在细胞内， 再使它与特定的底物反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的 原位上，最后使沉着物变为在电镜下可以看到的物质。在整个处理过程中 必须保存酶的活性不受破坏。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、 氧化酶和转移酶。
细胞生物学的研究技术
主要介绍4种生物学研究技术 一、膜片钳技术（patch clamp technique ） 二、电镜酶化学技术（enzyme cytochemistry technique） 三、单细胞凝胶电泳技术（single cell gel electrophoresis technique） 四、虚拟细胞（virtual cell）
四、虚拟细胞
虚拟细胞就是运用计算机信息科学的原理和技术，通过数学计算和分 析，对细胞的结构和功能进行分析、整合和应用，以模拟和再现细胞 和生命现象的一门新兴技术。因此，虚拟细胞亦称人工细胞或人工生 命。它具有系统性、模拟性、直观性、学科交叉性、无污染、无干扰 性、可重复性、高度可操作性和实验的周期短等特点。 虚拟细胞动画收藏吧/animations/ 虚拟细胞软件网站/cmbidata/vcell/default.htm/
（三）酶细胞化学的常规操作流程 1、固定：常规固定液选取2.5%戊二醛 和4%多聚甲醛混合液作为固定液，根据不同酶的特性，也可以单独使用其 中的一种作为固定液。一般固定液需要用缓冲液配置，具体需要使用何种 缓冲液要看具体酶的性质而定。常用的缓冲液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、 Tris缓冲液以及二甲砷酸钠缓冲液等。2、切片：一般采用组织切片机进行 切片，厚度在40-60UM，也可以用冰冻切片机切片。3、漂洗：用配置孵 育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10次分钟。4、孵育：孵育时必须使用在 使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内，在震荡式恒温水浴箱中孵 育，孵育温度一般在37℃。如果没有震荡式恒温水浴箱，在孵育过程中， 每5分钟摇晃一次，使孵育液混透均匀。孵育时间因器官和酶的种类不同 而有很大差异（具体时间见各种酶的孵育液的配方及孵育方法）。5、漂 洗：用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次，每次10分钟，然后用0.1M二甲 砷酸钠缓冲液漂洗3次，每次10分钟，所用缓冲液要保持在4℃左右。6、 后固定：用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。7、脱水、 浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。8、电镜观察：超薄切片经烘干 后直接进行电镜观察，如果反差不好，可以进行铅-铀双重染色，但必须有 不染色的切片作对照。
膜片钳技术的应用 膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以 作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务 。目前 膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、 病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。
应用举例 (1). 膜片钳技术在通道研究中的重要作用 应用膜片钳技术可以直接观察 和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可 发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进 一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外 物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究细胞信号的跨膜转 导和细胞分泌机制。结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子 通道分子结构与生物学功能关系的研究。
Neher
Sakmann
膜片钳技术的发展历史
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细 胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流， 从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得 到10-100G 的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现 了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技 术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、 1µm的空间分辨率和10µs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜 片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献， 荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖
(3).对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究 通过对各 种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解 该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离 子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明，缺血性脑 损害过程中，Ca2+ 介导现象起非常重要的作用，缺血缺氧使 Ca2+通道开放，过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载， 导致神经元及细胞膜损害，膜转运功能障碍，严重的可使神 经元坏死 (4). 在心血管药理研究中的应用 随着膜片钳技术在心血管 方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了 不断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的 观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和 Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为 特效的药物开辟了道路”