2 正确获得构建质粒载体克隆元件 一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获
得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的
切割位点既要保证元件完整无缺，又要使 DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必 要的序列，使构建的载体尽可能小。
构建质粒载体的基本原则
3 组装合适的选择标记基因
(3)四环素抗性基因 （tcr tetr）
(4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr)
(5)新霉素抗性基因（neor）
pBR322
pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列 已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。
含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基 因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。
4
5
构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，
可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶
基因)lacz’基因。
6
但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含 有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝 数的基因。
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分 别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分 为: 1）严谨型质粒(stringent plasmid)
拷贝数少，为1～5个 2 ）松散型质粒(relaxed plasmid)
拷贝数多，可达10个拷贝以上
某种质粒属于严谨型或是松散型的，与 宿主有一定的关系。
例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属 于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型 的。
将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr基因的DNA片段同含ColE1复制起始点 (来源于 pMB1、 松散型 )的DNA片段重 组，构建成质粒克隆载体 pBR322。
普通型载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
AmprHΒιβλιοθήκη ndIII BamHISalI
pBR322
非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
构建质粒载体的基本原则
1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等………..
构建质粒载体的基本原则
构建质粒载体的基本原则
5 在能达到预期目的的情况下，构建过程要 力求简单。
构建质粒克隆载体的基本策略
1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受 体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克 隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝 数。
2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源 DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点 应尽可能多。
多克隆位点
MCS
复制起始点 ori
遗传标记
Ampr
克隆载体
按功能分： 克隆载体 表达载体
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆 子的标记基因。
4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。
5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中 组装各种元件，构建成不同用途的质粒克 隆载体。
质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒 的作者或实验室名称，再加上质粒编号。
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
基因操作的基本步骤
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。