图解blast 验证引物教程
——以文献报道的人类的ABCG2的引物为例
1、 进入网页：/BLAST/
2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
3、 完成2操作后就进入了Basic Local Alignment Search Tool 界面 （1）在Enter Query Sequence 栏中输入引物序列：
注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
简便的做法是同时输入上下游引物。
输入上下游引物系列都从5’— 3’。
输入上游引物后，加上≥20个字母n ，再输入下游引物，如下图：
生 物 秀
（2）在Choose Search Set 栏中：
Database 根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript
或Others (nr etc.)。
本人倾向于选后者，觉得此库信息更多。
如下图：
（3）在Program Selection 中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：
（4）在此界面最下面：如下图
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Show results in a new window 项是显示界面的形式，可选可不选，在此我们选上了。
关键要点击Algorithm parameters 参数设置，进入参数设置界面。
4. 参数设置：
（1）在General Parameters 中：Expect thresshold 期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size 的下拉框将数字改为7。
如下图：
（2）Scoring Parameters 无须修改
（3）Filters and Masking 中，一般来说也没有必要改
5．点击最下面一栏的BLAST 按钮，如图：
6.点击BLAST 按钮后，跳转出现如下界面：
7. 等待若干秒之后，自动跳转出现显示BLAST 结果的网页。
该网页用三种形式来显示blast 的结果。
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（1）图形格式：
图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分
图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分
图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于80～120分，
分值越高，特异性越好。
线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。
图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。
没有连线的，表示单条引物与该基因一致。
点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。
（2）结果信息概要：
Accession 、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息 Desscription 、系列的简单描述
Total score 高的就是有两线段间有连线的，如图划线的。
E value ：代表被比对的两个序列不相关的可能性。
【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases 】。
E 值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。
设定的E 值是我们限定的上限，E 值太高的就不显示了
E 、最后一栏有的有UEG 的字样，其中： U 代表：Unigene 数据库
E 代表：GEO profiles 数据库 G 代表：Gene 数据库
（3）结果详细信息：
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划线上代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus 】的匹配情况： 划线下代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus 】的匹配情况： 共有20个碱基匹配，得分40.1分【20×2＋0.1＝40.1】，E 值为0.077。
为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种？ A 、 为同一个基因来源的不同的mRNA 片段 B 、 为该基因的DNA 系列 C 、 为同一个基因来源的不同的cDNA 克隆片段。
结果判断：
①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。
如果你blast 后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用
②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR 的非特异性扩增。
如果找到了你的目的基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而且分数也较高。
这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。
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