1、吸附法(link) 2、包埋法(link) 3、结合法(link) 4、交联法(link) 5、热处理法(link)
第六章酶与细胞固定化直接应用
酶固定化方法示意图
第六章酶与细胞固定化直接应用
吸附法
用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表 面上而使其固定的方法;
固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、 多孔玻璃等;
（1）固定化时酶活有损失； （2）增加了生产初始成本； （3）只能用于可溶底物且较小分子； （4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应； （5）胞内酶须分离。
第六章酶与细胞固定化直接应用
第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较 差 合成凝胶强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应 而使部分酶变性失活 适用性不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化
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(2)半透膜包埋法
半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几 十埃，比酶分子直径小 适用性底物和产物都是小分子物质的酶 微胶囊直径一般只有几微米至几百微米?
特点此法与共价结合法一样也是利用
共价键固定酶的，所不同的是不使用
载体
酶
双功能试剂戊二醛、己二胺、双偶氮
苯等
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得 到一种分子间交联的固定化酶
双功 能剂
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶 （immobilized enzyme)”
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什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
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制
备
酶+亲水性单体溶于水
混合
疏水性单体溶于有机溶液
亲水性、疏水性单 体在两相界面上聚
乳 化 剂
乳化
合成半透膜，将酶 包埋
酶液分散成小水滴
半透膜
酶液滴
Tween -20 破乳 离心
微胶囊型固定化酶
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（3）胶格包埋法
首先被采用的胶格包埋法是：
• 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
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酶
结合法
载
体
选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键(非共 价健)与酶结合在一起的固定化方法
(1)离子键结合法
载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶 等不溶于水的离子交换剂 操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时; 或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱; 活力损失少,结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时, 酶易脱落
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固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性； （2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或
反应液发生化学反应； （6）成本要低。
第六章酶与细胞固定化直接应用
一、酶固定化的方法
第六章酶与细胞固定化直接应用
溴化氰法
含有羟ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的载体，如纤维素等，可用溴化 氰活化生成亚氨基碳酸衍生物
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烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物 进行活化，形成含有卤素基团的活化载体
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交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构
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(2)共价键结合法
是载体结合法中报道最多的方法; 载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等; 也可分三类:天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞）、无机 物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙） 方法载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一能够与 酶分子上某一基团反应的活泼基团 优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间 缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响 酶的催化活性
第六章 酶与细胞固定化
直接应用酶的不足之处: (1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响 下,容易变性失活 (2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较 高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产 (3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难
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固定化技术
改善方法之一
思路设计一种方法,将酶束缚于特殊的相,使它与整体分 开但仍能进行底物和效应物的分子交换.这种固定化的 酶可象一般化学反应中的固体催化剂一样既有酶催化 特性,又有一般化学催化剂能回收，反复使用等优点,并 可使生产工艺连续化自动化.
种类
(1)固定化酶 (2)固定化菌体(死细胞) (3)固定化活细胞(增殖细胞) (4)固定化原生质体 (5)固定化动植物细胞
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载体活化方法
1、重氮法; 2、迭氮法; 3、溴化氰法; 4、烷基化法.
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重氮法
将含有苯氨基的不溶性 载体与亚硝酸反应生成 重氮盐衍生物，使载体 引进了活泼的重氮基团
第六章酶与细胞固定化直接应用
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迭氮法
含有酰肼基团的 载体可用亚硝酸 活化，生成迭氮 化合物
第六章酶与细胞固定化直接应用
优点
缺点
(1)提高酶稳定性； (2)可反复或连续使用； (3)易于和反应产物分开； （4）酶反应过程可严格控制； （5）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺； （6）较游离酶更适合多酶反应； （7）增加产物收率，提高产物质量； （8）酶的使用效率提高，成本降低。
(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性 失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不 牢固易脱落.
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包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的 固定化方法
多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明 胶、聚酰胺、火棉胶等
(1)凝胶包埋法