细鳞斜颌鲴种群的遗传分化及系统发生生物地理学研究武震M100102115水生生物学摘要：细鳞斜颌鲴（Xenocypris microlepis）属鲤形目，鲤科，鲴亚科，鲴属。

俗称：沙姑子、黄片。

我们将以中国各水系细鳞斜颌鲴种群为研究对象，以基因组微卫星标记和线粒体D-loop标记为线索，研究细鳞斜颌鲴种群的遗传分化及系统发生生物地理学特征，探讨相互间的遗传结构、亲缘关系和系统进化关系，为进一步开发和利用细鳞斜颌鲴资源奠定基础。

关键字：细鳞斜颌鲴，线粒体D-loop标记，微卫星标记，遗传分化, 亲缘关系, 系统进化1．研究背景细鳞斜颌鲴属中下层鱼类，平时喜生活于江河干支流水域，到了产卵季节，有一定的短距离洄游现象，上溯至适合条件的产卵场进行集群产卵。

产后，亲鱼分散游动，离开产卵场，至秋季有一部分群体进入干流附属的湖泊或支流中进行索饵、育肥，冬季则又返回干流水深的潭穴中越冬。

细鳞斜颌鲴的食性很杂，自全长2厘米以上的夏花鱼种开始，除摄食少量浮游生物外，主要是腐屑、底泥以及底生硅藻和摇蚊幼虫等底生生物。

它在不同类型的水体中，均以腐殖质有机碎屑、腐泥及着生藻类为主要食物。

其生长在头两年速度较快，2龄鱼的平均体重可达479克。

细鳞斜颌鲴通常2冬龄性成熟，生殖季节在华中和华南地区为4―6月。

成熟雌鱼的体重变化在415―1100克以上。

平均每千克体重的鱼怀卵量为20万粒左右。

产粘性卵，呈浅黄色。

产出时卵径为0.8―1.2毫米。

雄鱼在生殖季节，有珠星出现。

广泛存在于东部各水系之中。

故各水系之间的种群长期存在地理隔离，基因交流困难，是一个良好的进化生态学研究材料。

国内对此鱼的研究也不多，且多为形态学方面的资料，研究其分子进化和群体遗传，有助于了解该种的资源状况，同时能够为生态学相关理论提供依据。

2．方法2.1采样分别采钱塘江，长江，珠江水系细鳞斜颌鲴，每条水系定5—7个点，如钱塘江水系如图：钱塘江水系采样图每个采样点取30—40尾鱼尾鳍，用95%酒精保存备用。

2.2 基因组微卫星分子标记微卫星DNA (MicrosatellitesDNA) 又称短串联重复序列( short tandem repeats, STRs) 或简单重复序列( simp le sequence repeats, SSRs) , 是广泛分布于真核生物基因组中的一种特殊序列, 主要由串联重复单元组成, 每单元长度为1～6 bp，重复数为10~20 次。

它具有按照孟德尔方式分离、突变快、多态信息含量丰富、呈共显性遗传等特点。

它是继RFLPs标记之后发展起来的第二代分子标记,在水生经济动物的良种培育、群体遗传分析、亲子鉴定、遗传图谱构建、系统发育、医学及亲缘关系鉴定等研究领域表现出了广泛的应用价值。

微卫星DNA 标记具有突变率高、共显性好、多态信息容量高、特异性的PCR 扩增、引物通用性好、PCR扩增结果重复性好、技术难度低等特点，集中了其他分子标记的优点，被认为是研究群体遗传变异最好的标记方法之一。

微卫星DNA的重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的。

这些重复序列两端大多是保守的单拷贝序列, 因此可以根据保守序列设计特异引物, 通过PCR 技术将中间的核心重复序列扩增出来, 利用琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术可获得其长度多态性SSR具有RFLP的所有遗传学优点,且避免了RFLP 技术中的使用放射性同位素的缺点,又比RAPD的重复性和稳定性高, 因而目前已成为遗传标记中的研究热点。

然而由于SSR 技术必须针对每个染色体座位的微卫星, 发现其两端的单拷贝序列才能设计引物, 这给微卫星标记的开发带来一定的困难。

微卫星最突出的优点是具有高水平的变异，且其多态信息易于通过PCR技术获得，与同工酶或其它标记相比，微卫星更适合于亲缘关系较近的生物群体间的遗传关系研究。

因此我们可以利用微卫星，大力开展水生动物特别是不同地理群体或品系的遗传结构研究。

本试验我们采用基因组微卫星标记, 来研究各伍氏华鳊种群的遗传分化，群体遗传多样性，探讨系统发生关系。

2.3 线粒体D-loop环标记自从Nass夫妇(1963 ) 发现线粒体DNA( mitochondrial DNA , mtDNA) 以来,核外遗传系统的研究逐渐成为分子遗传的重要研究领域之一。

迄今已广泛应用于动物进化、动物遗传育种、动物保护生物学,动物亲缘关系鉴定、海关进出口动物产品鉴定等。

线粒体基因为非孟德尔式的遗传,在杂交后代中的表现不符合遗传学的三个基本规律,既不出现分离和自由组合现象,也不存在连锁与交换的关系。

同时正反交结果也是不一样,杂种后代通常只表现母本的特征,而与父本性状无关,具有明显的核质基因互作关系。

线粒体基因的遗传不是独立的遗传行为,常常表现为与核基因的相互作用。

在绝大多数动物中,线粒体基因组的结构为环状，包括编码区和非编码区。

编码区内含有37 个基因:2 个SrRNA基因、22个tRNA基因、13个蛋白质基因（细胞色素C 氧化酶亚基Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ基因、细胞色素b脱氢酶基因、ATP合成酶6 和8 、NADH脱氢酶亚基126 和4L）。

非编码区是线粒体基因组的调控区，又称为D 环(D-loop) 。

Cytb，12SrRNA，16SrRNA，ATP8等基因多用于研究物种间系统发育和基因的进化；D-loop 区序列多用于研究物种的遗传多样性、群体遗传结构及亚种的分化。

D-loop(displacement-loop region)占mtDNA的6％左右，不同动物的D-loop分子大小差异很大，从几百个碱基到几千个碱基不等，同一物种其大小也有略微差异，各种动物D—loop结构也不尽相同。

D-loop也是mtDNA复制与转录的关键部位，因此又把它称为线粒体的控制区(control region)。

在碱基组成上，D-loop为A-T富集区，依照碱基A的比率，又可分为左功能区(包括D-oop的5’端)、中间保守区和右功能区(包括D-loop的3’端)部分。

左功能区和右功能区为A碱基富集区，在遗传上为高变区，分别称之为高变区I和高变区Ⅱ，其碱基突变率比mtDNA其它编码区域高5-10倍，该区存在容易发生缺失或扩展的变异点，中间保守区为G碱基富集区，遗传上为保守区。

线粒体DNA(mtDNA) 以其严格的母系遗传和较快的进化速率,成为一种探讨物种起源、系统发生和种内遗传分化的有效遗传标记。

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制控制区(D-loop区)是线粒体非编码区中较为重要的区域，参与并调节mtDNA的复制与转录。

然而，与核基因组不同的是，mtDNA的复制与转录并不是相互独立的，而是存在着密切的联系。

从目前的研究看来，复制控制区的某些变化很可能会引起mtDNA复制与转录的变化，从而导致线粒体功能的变化。

D-loop因缺乏编码的选择压力而比其他线粒体基因的进化速率更快,因此,线粒体DNA控制区序列在近缘物种、快速形成物种间的系统进化以及种群遗传多样性研究等方面应用颇为广泛。

线粒体D-loop 分析是一项新兴的技术,目前在鱼类研究中已经做了很多工作。

D-loop 不仅在确定某种鱼类种内种群结构和遗传分化、进化地位、物种保护以及物种进化与地质演化相互间关系等方面有重要意义,也能为确定稀有基因型鱼类、鱼类遗传瓶颈效应和基因流动等研究提供证据。

尤其是对于那些土著淡水鱼类,长期的地理隔离是否产生了基因隔离? 这些种群在漫长的进化过程中是否有产生新物种的趋势? D-loop 分析技术也许是阐述这些问题的有效工具。

随着DNA 测序技术和分子信学的快速发展,mtDNA在鱼类系统学、种间杂交渐渗、分子群体遗传学等方面得到广泛应用。

测定线粒体DNA 全序列或部分基因片段序列可以直接反映碱基的置换、插入、缺失等实际情况,通过比较不同物种或个体碱基序列的差异,从而探讨进化关系,比其他分析方法具有更大的优点。

本研究旨在分析我国各水系的细鳞斜颌鲴mtDNA控制区全序列的变异和种群遗传结构,为制定该物种的资源保护和利用策略提供依据，同时为了解该淡水土著性鱼类的生态进化提供一个良好的模型。

2.4 数据统计2.4.1微卫星数据分析经过PCR扩增之后，可以产生不同重复单位数目的等位基因，由于他们之间的片段长度存在差异，经电泳后这些不同的等位基因之间可以发生分离，这样就可以知道核苷酸重复单位数目的差异。

用Popgen32软件计算平均杂和度（average 和特rozygosity，H）及群体间遗传分化指数（f st）；利用FATAT293软件分析各位点及群体的基因丰度（alleles richness ，Ar）；多态信息含量（polymorphism information content，PIC）参照Botstein等提供的方法计算。

利用Dispan软件计算Nei氏D A遗传距离，并根据D A遗传距离用Mega3.1 软件构建各个群体的UPGMA聚类图，群体间的基因流通过公式Nm=（1-f st）/4f st计算。

2.4.2线粒体D-loop环标记数据分析控制区序列的对位排列( alignment) 使用ClustalX 软件,并在SEAVIEW程序中对序列辅以手工校正。

遗传变异分析采用Mega3.1软件。

细鳞斜颌鲴各单倍型间系统发育关系的重建采用邻接法(Neighbor2Joining,NJ ) ,以另一种鱼的mtDNA控制区序列为外群,以Kimura双参数法( Kimura22parameter) 为替代模型,采用Mega3.1 软件进行分析,系统树分支的置信度采用自引导法( bootstrapanalysis,BP )重复检测,设置为1000 次重复。

ArlequinVer.3.01软件用于统计种群核苷酸多样性(nucleotidediversity,π) 、单倍型多样性(haplotypediversity, h) 及其标准差(SD)。

采用分子变异分析方法( analysisofmolecularvariance,AMOVA) ,以10000 次重复随机抽样单倍型,重排后进行显著性检验,用于估计细鳞斜颌鲴种群遗传结构及不同地理种群遗传变异的分布。

群体间分化指数( F ST) 和基因交流值( N m) 利用DnaSPVer.4 .10软件分析。

3结果与讨论因为从单个基因评估细鳞斜颌鲴不同群体的遗传多样性差异和确定进化特征还不够。

所以我们综合运用多种分子标记，同时把线粒体D-loop环和基因组微卫星结合起来进行研究，以得出更全面、客观的结论。

通过这两种分子标记手段，我们将更好的弄清我们各水系细鳞斜颌鲴种群的遗传分化情况和生物地理学特性等，了解隔离导致的生态学效应。