海洋生物资源综合利用实验指导海洋学院2017年8月29日实验一琼脂的制备一、目的和要求1. 学习和掌握以石花菜为原料，制备琼胶的基本原理。

2. 熟悉和掌握制备琼胶技术关键和基本操作方法。

二、实验原理琼胶是一种半透明乳白色或浅黄色条状或粉状固体。

其主要成分是D-半乳糖与3.6-脱水L-半乳糖等组成的高分子化合物，其分子量约为1.1×109~30×109，不溶于冷水而溶于热水，1%浓度的琼胶溶液其凝固点30~40℃，其熔点为８０℃，琼胶溶液冷却后即成凝胶。

琼脂的生产方法以石化菜、龙须菜、江篱、末水紫菜等为原料制备。

其制备方法不尽相同。

不同之处，主要是原料前处理。

根据原料的种类选择不同的预处理方法, 以石花菜为原料只需除去杂物即可; 以江蓠、紫菜为原料, 则需用一定浓度的碱液处理,以提高琼脂质量。

碱处理后, 用水洗至中性。

究其原因是原藻粘质物中含硫酸酯的数量不同所致。

红藻类之粘质物系多糖类与硫酸根结合称酯状，其中酸性部分与某些金属离子成盐类形成O.SO2.OR M(Ca2+或Mg2+等)者O.SO2.O为琼胶质，以石花菜类含量很多。

反之不能、与金属离子成盐，而只能成酯状结构者如只能充做糊料而不能成为琼胶。

O.SO2.OR R′(配糖体)O.SO2.O将原藻加NaOH及CaCl2溶液加热时，即生成如下化学反应，使无凝固性之部分成钙盐而致使具有凝固性。

O.SO2.O O.SO2.OR R’+Ca2Cl+H2O R Ca2++R’OHO.SO2.O O.SO2.O经过碱处理后的原藻，其藻体中以人工形成了O.SO2.OR Ca 亦即可使其变成能提取的琼胶形态.O.SO2.O另外，有的原藻如紫菜表面有一层含有纤维质的表皮细胞，在加热提取琼胶时，须在煮水中加酸或将碱处理的紫菜予以酸处理，以破坏表皮细胞，而有利于琼胶成分之提取。

三、材料、试剂及仪器1. 材料：石花菜或末水紫菜2. 试剂：氢氧化钠、硫酸、盐酸、漂白粉3. 仪器：自动控制加热器一套、烧杯、抽滤器、红外线水分测定仪、称量瓶、天平、凝胶强度测定器。

四、工艺流程原藻—→碱处理—→水洗—→漂白—→水洗—→提取—→过滤—→凝固—→截切—→冻结—→融解—→脱水—→干燥—→琼胶五、操作方法1. 碱处理：将原藻所附着之土砂、贝壳、盐分、杂藻等除去。

称取一定数量的原藻100g，加入500 ml的8%NaOH溶液，NaOH的纯度及配制液的水质对琼胶产品颜色会有影响，碱液中含Fe3+多，则琼胶颜色变深。

原藻在常温下浸泡1天，浸泡过程中要经常搅拌，使制裁中色素不断浸出，原藻不断溶胀，以减少后工序水煮提胶的时间。

2. 水洗、水浸：叶片应在低温下水洗，防止在高温条件下琼胶成分流失。

水洗所用的水应洁净，如水中杂质多，琼胶颜色较深，水洗必须充分，水容量应为原藻的100倍，反复漂洗，直至叶片呈中性为止。

水洗后进行水浸，叶片一经浸泡膨胀，有利于后工序漂白，也缩短水煮提胶时间。

在水浸过程中要多次更换清水，尽量叶片中色素溶解渗透出来，水浸时间应在12小时以上。

水浸后将原藻滤出，然后进行漂白。

3. 漂白：漂白是影响琼胶颜色的重要步骤，为了得到乳白色半透明琼胶，应尽可能除去色素。

漂白操作时，应先将漂白液配成一定浓度后，然后加入要漂白的叶片，不可将浓的漂白粉溶液加入，防止局部浓度过高，琼胶分子断键，降低产品的质量。

漂白操作温度不宜过高，否则胶量损失多，但温度低漂白的效果差。

漂白溶液要保持中性，当pH<4时，琼胶易断键，如果pH>8时，琼胶颜色变深。

漂白后的原藻过滤，除去漂白液，进行水洗。

漂白操作：将已洗涤的碱处理原藻，在常温下浸渍于500 ml 0.05%漂白粉溶液中（漂白粉含有有效氯约60%），浸渍20分钟后，取出改浸渍在500 ml 0.001%硫酸溶液中，30分钟，漂白操作结束。

4. 漂白后水洗：漂白后原藻中仍留有漂白剂，要充分洗涤，否则到下一步水煮提胶时，会在高温下使琼胶氧化断键，成为糊状胶液。

5.提胶：处理后的原藻，加入500 ml蒸馏水，放入微波炉中等火力微波15 min，微波炉20 S间隔打开，避免沸腾，溢出胶液。

高压锅温度调节到100 ℃，高压蒸煮1h。

7. 过滤：提胶结束后，琼脂即由原藻扩散于溶液中，纱布过滤至不锈钢托盘中。

过滤温度在60度左右，以防止胶液冷却而胶凝。

8. 凝冻、切胶：将琼胶胶液住入不锈钢或瓷盘中放冷，凝固后切成条状，冷却温度应在25度以下，否则将延长冷却时间。

9. 脱水：为了脱去在琼胶中所含大量水分（约98.5%），可采用下列两种方法：一种是冻结融解法，一种是加压脱水法。

本实验采用冻结融解法。

方法是：将切成条状的胶冻放入0~-6℃之冰箱内预冷，经约24小时后改以-15℃，时间页是24小时，如一开始就用-15℃，则因琼胶凝胶之热传导度不佳，仅表面急速冻结，生成冻结膜，而对于内部具有保温作用，当融解时会使未冻部分流失，影响得率。

冻结后之琼胶，可用冲水的方式将所含之水分溶解之。

10. 干燥：经融解脱水后的琼胶仍含有大量的水分，均须经过干燥后才能成为成品，一般所用的方法有三种，即低温干燥；热风干燥和红外线干燥。

本实验采用热风干燥。

方法是：将脱水后之琼胶凝胶置于干燥网上，并移于鼓风干燥箱内，加热至50~55℃干燥3~4小时即可完成。

补充：琼脂糖的纯化称取1．25 g EDTA—Na2：于烧杯中，加入200 ml蒸馏水，搅拌使之溶解，再加入l1．35 g琼胶，加热至60 C，然后在60 C下恒温4 h，并不断搅拌，这时EDTA 使硫琼胶（琼脂胶）成水溶性而琼脂糖不溶，过滤，用水充分洗涤，浸泡过夜，自然干燥即得琼脂糖。

六、产品检验1. 琼胶的成分：以Agarose及Agaropectin组成，并以前者为主，其他热水可溶性之多糖氨基酸，着色物质，无机盐等均为琼胶之不纯成分。

2. 琼胶的水分：通常琼胶的含水量为10~20%，国家标准为22%以下。

3. 粗灰分：普通含有1-2%或1%以下，在提取过程中如添加无机物药品，将回使成品之灰分增加，至于琼胶之碳水化合物（尤其是Agaropectin）结合之硫酸根或微量金属成分也成为灰分。

4. 粗蛋白：本成分之来源为原藻之色素和蛋白质等，原藻之预处理和水洗过程将影响其含量，成品中含量愈低愈佳，一般含量在1%以下。

5. pH值：琼胶胶液应在pH6.0~8.0之间，如不在此范围内，则可能为药品之添加不当所致。

6. 凝胶强度：凝胶强度与凝胶之粘度或弹性未必成正比，普通胶强度100~150g/cm2者，用手一拿即碎；250~300g/cm2者为中等强度，350g/cm2以上者，稍微用力亦不会破碎。

成品琼胶贮存后，因分子结构之变异而起老化现象，使胶强度降低。

7. 融点（融解温度）琼胶凝胶可液化之温度成为融解点，通常浓度为1.5%者，融点为80~85℃，优质琼胶在85℃以上。

8. 凝固点（凝固温度）琼胶可固化之温度成为凝固点，通常浓度为1~1.5%，凝固点为28~38℃，一般在30℃左右即可。

融点与凝固点相差50~60为琼胶一大特征。

9. 计算成品琼脂的得率。

七、问题及讨论1. 提胶前的原料藻体为什么要进行碱处理？不处理能否提胶？2. 影响琼胶凝胶强度的关键是什么？3. 影响琼胶得率的因素有那些?(包括原料和工艺)4. 如何进一步纯化琼脂中琼脂糖？实验二蛋白胨的制备一、目的和要求1. 学习以低值杂鱼或鱼粉为原料，用AT3942中性蛋白酶作水解剂，制备蛋白胨的原理和方法。

2. 初步掌握制备蛋白胨的有关操作技术。

二、实验原理蛋白质是由无数氨基酸缩合而成的高分子化合物，其结合方式可以下列反应式表示。

当蛋白质在酸、碱酶或高温高压下，分子上的肽键（-CO-NH-）逐渐断裂而水解成多肽和氨基酸等。

故酸碱度、温度、时间等水解条件的不同，多肽、氨基酸所生成的量也不同，因此，控制一定的水解条件，就可以决定水解产物的成分是多肽或是氨基酸，从而确定生产蛋白胨或氨基酸的工艺条件。

蛋白质分解产物，如将牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明胶、大豆蛋白、丝蛋白、血纤维蛋白等为原料，经不完全的水解工艺所得的产物。

市售产品以淡黄至棕黄色粉剂为主。

其分子量介于胨和肽之间，约2000左右。

不同来源的蛋白质和不同的水解条件，其水解物中组成可千差万别。

所以胨往往是一个复杂的多肽混合物。

可溶于水，过热不凝固，在饱和硫酸铵中不发生沉淀但可为蛋白质沉淀剂所沉淀。

可用作微生物和动物细胞培养基、特种功能性食品和化妆品的配料，也有用作啤酒等产品的稳定剂。

三、试剂和仪器1. 试剂：新鲜杂鱼或鱼粉；石灰或氢氧化钙；工业硫酸；工业氨水；冰醋酸；AT3942中性蛋白酶。

2. 仪器：100℃温度计；尼龙布；布氏漏斗；各种烧杯；恒温水浴锅；电炉；抽滤瓶；pH滤纸或酸度计；电动搅拌机；高压消毒锅；真空薄膜浓缩器；真空干燥或喷雾干燥器。

三、工艺流程水解：中性蛋白酶、石灰或氨水新鲜杂鱼————————————→水解液50~55℃8小时pH8~9过滤：除蛋白：粗滤、细滤用石灰或氨水过滤————→滤液—————————→滤液真空过滤pH9.5 加热至沸除酸性蛋白：浓缩：H2SO4或HAC静置真空薄膜喷雾干燥————————→滤液—————→浓缩液—————→蛋白胨干粉pH 5加热、过滤波美90~100四、操作方法：1. 水解：将鱼粉100克，水400毫升置于玻璃烧杯中，在不断搅拌之下，加入石灰水，调pH至7，开始加热，温度保持在50±1℃，加入AT3942中性酶1.6g（加入重按1克鱼粉加3000单位蛋白酶）。

水解8小时后停止加热。

2. 除酸不溶蛋白：水解结束后，在水解液中加石灰水调pH至9.5，放入压力锅内加热1小时，压力保持在121℃（1.4公斤/厘米2）。

降温后过滤，滤液中加硫酸。

在不断地搅拌之下调整pH至4.0-5.0。

低温（10℃以下）放置24小时，吸上清液，残渣经水洗后，洗液与上清液合并。

3. 活性炭脱色、脱腥：加入一定含量活性炭（如1%）混匀后离心，含量高时多肽会有一定损失。

4. 浓缩和干燥：上述滤液在常压下煮沸浓缩或在真空下进行浓缩，浓缩至波美度（表示溶液浓度的一种方法）至9~10。

浓缩液分装于搪瓷盘内，90℃以下真空干燥或直接进行喷雾干燥而得成品。

5. 包装：蛋白胨成品是粉状物，极易吸潮，故包装要迅速，装入玻璃瓶后，必须马上盖紧瓶盖，以确保密封。

五、成品质量1. 溶解度：取样品10g，加蒸馏水500ml，摇匀，应在30分钟内全部溶解。

2. 色泽：淡黄色或黄色。

3. pH值：取上述之2％溶液，测定pH值应在4.5~7.0之间。

4. 透明度：上述溶液加热煮沸，放3分钟，应透明。

5. 沉淀：将上述溶液调节至pH9.2，放入试管中，塞上棉花塞，高压灭菌（1公斤压力）20分钟，不得有沉淀，然后再于4的环境中过夜，不得有沉淀。