组织分离法制备食用菌母种（8学时）
一、实验的目的和要求
1、学会母种培养基的配制方法。

2、掌握组织分离的方法和技术。

3、掌握母种转管继代培养技术。

4、掌握无菌操作技术。

二、实验内容或原理
（1）母种培养基配制。

工艺流程：培养基配方培养基的配制灭菌
摆斜面
（2）菌种分离与培养（本实验以组织分离为例）。

工艺流程：种菇的选择与消毒组织块的切取菌丝培养
三、实验材料
仪器：超净工作台、高压灭菌锅、电炉、天平、试管、试管架、解剖刀、漏斗、漏斗架、橡皮管、玻璃管、止水、牛角勺、棉花、纱布、酒精灯。

试剂：75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等。

四、实验步骤
（1）母种培养基配制
A、培养基配方：以PDA培养基为例，马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml。

B、培养基配制：首先将马铃薯去皮、洗净、挖去芽眼、切成薄片，称取200 g，放入铝锅中用1000ml清水加热煮沸，维持20min左右，煮至软而不烂为止。

用双层湿沙布过滤，然后取滤液并补足蒸发损失的水分。

再加入琼脂继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖及其它成分，搅拌均匀后准备装管。

C、分装试管：培养基配制后应趁热分装。

装管时勿使管内外壁沾上溶液，以免浸湿棉塞，污染杂菌。

装管后塞上棉塞。

棉塞的大小、松紧度应适宜，以用手提棉塞、试管不脱落为准。

然后每10支度试管扎成一捆，棉塞上方用牛皮纸包好，避免灭菌时被水蒸汽浸湿。

D、灭菌：灭菌前将水加至锅内水位标记高度。

将试管放入锅内，盖上锅盖，对角旋紧锅上螺旋，并闭排气阀，开始加热,当锅内蒸汽大量排出时再继续排汽3-5 min,关闭放气阀.当压力表指针指到0.15 Kg/cm2时(灭菌所需压强)开始计时,继续维持该压强30min。

灭菌结束持压力表指针自然回到”0”位时打开放汽阀,排出锅内剩余蒸汽后,打开锅盖.注意切忌在压力表未到”0”位时就放汽,以免试管内的培养基向上冲浸湿棉塞,造成以后菌种的污染.
E、摆斜面：当培养基的温度降到60℃时，将试管斜面放在木棒上，使呈斜面，斜面的长度以占试管长度的1/2为宜。

冷却后即成斜面培养基。

(2)菌种的分离与培养（本实验以组织分离为例）
种菇的选择与消毒：选择出菇早，菇形正，菇盖肥厚，具有该品种特征，无病虫害、无杂菌污染，子实体八九分成熟的作为种菇。

种菇选定后，用75%酒精进行表面消毒。

组织块的切取：将斜面培养基放进超净工作台内，用紫外灯（或化学药品）进行消毒0.5h以上,关闭紫外灯后20min后,再开始进入接种室内进行接种。

接种是一项技术性很强的工作，需要在无菌的环境中以无菌操作方法进行接种，才能减少污染。

无菌操作是接种过程中最基本的操作方法，要求操作熟练，动作迅速。

用无菌刀在菇柄或菇盖中部纵切一刀，然后用手将菇体掰成两面三刀半，在菌柄和菌盖交界处用刀切取0.3-0.5cm2的小方块组织,将其移接到试管内培养基的中央，将其移接到试管内培养基的中央。

菌丝培养：接种后置于25℃恒温箱中培养,2-3天后可见组织块周围发生白色绒毛状菌丝,此时每天要检查杂菌污染情况.培养7-10天后,菌丝即可长满斜面。

菌丝长满试管即为一级种（母种）。

（可进行母种转管继代培养。

）
思考题：
1、组织分离获得菌种的理论依据是什么？
2、用组织分离方法获得的母种，为什么要进行出菇试验后才能用于生产？。