噬菌体一、生物学特性噬菌体（Phage）属于非细胞型微生物，是侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒。

它们个体微小，通常仅能在电子显微镜下观察到；结构简单，多数噬菌体仅由蛋白质和核酸两种成分组成，蛋白质构成的衣壳包裹着核酸。

在自然界单独存在的噬菌体不表现出生命规象，但具有潜在的生命力。

噬菌体从吸附至宿主细胞上的一瞬间，就开始了自己的生命过程。

根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体。

烈性噬菌体通过吸附、侵人、生物合成、装配与释放等步骤使宿主细胞裂解死亡；而温和噬菌体侵染宿主后，则将其核酸整合在宿主基因组上，并以原噬菌体状态存在，宿主则转为溶原性菌株；但有时也有机率较少的温和噬菌体与烈性噬菌体一样，引起宿主细胞的裂解死亡。

温和噬菌体对溶原状态和裂解途径的选择，取决于感染细胞内的一些宿主基因产物和噬菌体基因产物活性之间的平衡。

[1]噬菌体广泛分布于自然界是与其宿主的广泛分布分不开的。

迄今为止，几乎没有一群细菌尚未发现其相应的噬菌体，只有那些我们了解的还很肽浅的细菌才尚未见其相应噬菌体的报导。

[2] 根据大小、形态结构特征，可以把噬菌体分为3种类型，一是蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体，其头部为二十面体，直径约110 -120nm，尾部长220-230 nm,尾宽13-15 nm,无尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构。

二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70nm x 110 nm，尾部长约120 -130 nm,尾宽约18-22nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构，该噬菌体似有包膜。

三是短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20 nm，尾部长约2-3 nm。

[3]图1. 噬菌体生活周期二 噬菌体的繁育技术1. 繁殖方式噬菌体为非细胞型微生物，其增殖(复制)方式与细菌的繁殖(二分裂)方式不同，从吸附宿主菌到子代噬菌体的释放是一个爆发的过程，表现为“一步生长”的特点。

一步生长实验于1939年Ellis 和Delbruck 创立，据此可以测知噬菌体在细菌内增殖的潜伏期即每一个细菌产生噬菌体的平均裂解量。

微生物一步生长曲线试验可以筛选出潜伏时间短、裂解量大的噬菌体，以表明噬菌体的裂解能力。

噬菌体感染宿主菌的潜伏期和爆发期的长短以及爆发量的大小与噬菌体、宿主菌及环境条件都有关系，因此每种噬菌体都有其独特的一步生长曲线。

[4]2.保种保存噬菌体的条件为噬菌体原液4℃，液态体系为乳清和M17(或MRS)液体培养基。

噬菌体存活率的测定：将待测噬菌体液用无菌移液管进行对倍稀释，双层平板法记数噬菌斑；每7d测1次。

[5]三噬菌体的培养管理1. 噬菌体的分离在盛有50 mL 3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，加入污水样品70 mL与2mL噬菌体标准宿主菌增菌液混匀后，于37℃培养12 -24 h。

将以上增殖培养的混合培养液以12 000r/min离心20 min，取上清液，继续离心20 m in，取上清液，在无菌操作台上，用灭菌的蔡氏过滤器过滤除菌，滤液即为此宿主菌噬菌体的原液。

[6]2 菌体的检测在无菌操作台上，取0. 1 mL标准宿主菌增菌液于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，涂布，待干燥后，取0.08mL噬菌体原液分滴滴于其上，待干燥后，倒置于37℃温箱培养过夜后观察结果。

如果原液内有噬菌体存在，则在滴加原液处无菌生长，呈蚕食状的空斑，即噬菌斑。

若无噬菌斑出现，则表示无噬菌体。

3 噬菌体的纯化用蛋白胨水溶液将噬菌体原液分别稀释成原浓度的10-1～10-7倍，分别吸取7个不同稀释度的噬菌体各0. 1 mL与0.2mL标准宿主菌增菌液混合，然后加入到盛有4. 5～5. 0 mL 且保温约45～50℃的半固体上层培养基试管中，混匀倒入固体琼脂平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后，倒置，37℃培养3. 5～5h。

在上述出现单个噬菌斑的平板上，用枪头在选定的噬菌斑上刺一下，浸泡于1 mL大豆胰蛋白胨液体培养基中，4℃过夜。

次日，取0. 1 mL上清液和0. 1 m L 标准宿主菌增菌液接种于5mL大豆胰蛋白陈液体培养基中，37℃培养3. 5～5h，离心过滤，再依次稀释，重复双层板纯化操作，依次类推，至少重复3次。

每次所观察到的噬菌斑的大小和形态应保持均匀一致，方可得到纯化的噬菌体原种。

[7]4 双层平板扩增步骤①将培养至对数期的宿主细菌悬液和噬菌体母液按1 ：l比例充分混合，然后在3 7 ℃条件下温浴培养2 0 mi n ；②将①中的培养物加入融化的半固体培养基中，然后迅速倒入事先准备好的固体培养基平板；③待上层半固体培养基凝固，将平板倒置放入 3 7 ℃培养箱培养8 ～1 2h( MS 2 )或 5 h(ØX1 7 4 ) ；④培养完成后，选择噬菌体长满的平板，将上层半固体培养基全部用刮刀刮入离心管，然后在4 ℃条件下以 1 0 0 0 0 r／mi n( 即1 2 0 9 6 x g )离心1 5 mi n ，取上清液，即得到培养好的纯噬菌体溶液，每个平板大约可得1mL左右的噬菌体溶液，其浓度可高达l 0 p fu/ml( MS 2 )和 1 0p fu/ml(ØX1 7 4) 。

[8]4. 噬菌体的热稳定性测定将噬菌体原液稀释至107 pfu/mL，分别于50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80℃保温1h，每隔5 min取样，样品立即置入冰浴中冷却，经适当稀释后，测定噬菌体效价。

5 噬菌体的pH稳定性测定分别取不同pH的1%蛋白胨液4. 5 mL加入到内径为12 mm的试管中，置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入0. 5 mL 107pfu/mL的噬菌体溶液，恒温保存1h后，将蛋白陈液进行适当稀释，测定噬菌体效价。

6 Ca2+、Mg2+离子浓度对噬菌体效价的影响调节软琼脂层中Ca2+或Mg2+的不同浓度，取适当稀释度的噬菌体溶液，测定噬菌体效价。

[9]7 噬菌谱的测定以各种菌分别为指示菌，与适量的噬菌体铺双层平板。

上层琼脂均为7 g/ L 的LB琼脂，大肠杆菌的下层琼脂为麦康凯琼脂，禽多杀性巴氏杆菌的下层琼脂为马丁琼脂，二者的观察时间均为6～12 h。

8 噬菌体核酸类型的测定取噬菌体浓缩液，用病毒基因组提取试剂盒( TIANGEN公司产品)提取噬菌体的基因组，分别以RNase A、DNase I和绿豆核酸酶按各自说明书进行酶切，经10g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果。

[10]四噬菌体的应用1. 治疗细菌感染噬菌体对一些细菌具有高度的专一性，当噬菌体侵染细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌；而它对动植物没有毒性。

因此，噬菌体以其特有的自然特征有望成为较好的抗菌药。

在抗生素发现和广泛使用之前，人们就提出运用噬菌体来治疗细菌感染。

虽然人们很早就发现噬菌体，但人们忽略了运用噬菌体来治疗细菌感染的可能性，此中的原因很复杂。

抗生素的发现转移了人们对噬菌体治疗研究的兴趣，至今仍对噬菌体治疗缺乏有力的评价。

但随着致病菌对大多数抗生素产生抗性的出现，细菌的耐药性己成为现代医学中的一个非常严峻的问题，人们担忧人类重新进入“前抗生素”时代。

现在人类急需发展其它抗感染药物，噬菌体治疗的不断研究可能会成为抵御病菌感染的又一个有力的武器。

噬菌体一般是通过holin和细胞内溶素两种物质造成细菌裂解。

在裂解循环的末端，holins通过寡聚化诱导细胞质膜的损伤，接着细胞内溶素分解肽聚糖，便造成细胞的裂解。

噬菌体k的S- holin基因是由一个双起始位点的序列编码的，可产生两种在N末端仅有两个氨基酸差异的S-多肽。

两种S多肽的氨基酸组成数分别为105( S105)和107( S107) , S105对膜损伤的形成起促进作用，而S107起到抑制作用[11]。

Graschopf等将铜绿假单抱菌的噬菌体P13的主要外壳蛋白p V Ⅲ与S105的N端融合，改造后的噬菌体具有高效杀死细菌的能力。

[12]2. 噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌根据噬菌体D29能够感染、裂解结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的特点，英国学者研究开发分枝杆菌噬菌体试剂盒(FASTPIaqueTB TM)用于快速检测结核分枝杆菌。

试验的基本原理是:当结核分枝杆菌与噬菌体D29混合孵育时，噬菌体感染前者，其后加入噬菌体杀灭剂，杀死靶菌体外培养基内游离的噬菌体，而菌体内的噬菌体不受影响。

感染的噬菌体在靶菌体内繁殖并裂解菌体释放子代噬菌体，这些噬菌体又感染和裂解随后加入的指示菌细胞(耻垢分枝杆菌)，在琼脂培养基上形成噬菌斑，噬菌斑的数日与标本内活的结核分枝杆菌的数量成正比。

[13] 3.噬菌体展示技术3.1 与蛋白质相互作用的研究蛋白质组学(proteomics)是研究参与特定生理或病理状态下的所有蛋白质种类及其与周围分子的关系。

其研究特点是蛋白质种类众多且量微。

蛋白质的结构决定蛋白质的功能，而蛋白质功能的发挥在很大程度上依赖于蛋白质之间的相互作用，蛋白质之间的相互作用及识别是通过局部肽片段间的相互作用实现的。

而这些需要高通量和高灵敏度的研究工具。

噬菌体展示筛选系统是用来筛选新的结合蛋白的一个非常简单、有效的手段。

该技术在蛋白质相互作用中的成功应用，有望在人类功能基因组学和蛋白质组学研究中发挥重要作用。

3.2在筛选和制备多肽药物方面的研究及应用在传统的新药开发上，由于对蛋白质结构与功能关系不够了解，所以不能随机设计出具有新功能的新蛋白质，要获得新型功能蛋白的传统方法只能通过大规模的定点突变和费时的单个目的蛋白的克隆表达纯化与筛选来修饰现有蛋白。

而噬菌体展示肽或蛋白质的结构与功能常常与天然肽或蛋白质具有同样或极为相似的结构与功能，利用此特点，在天然蛋白质或特定功能的框架分了噬菌体展示文库中，以一定功能的靶分子筛选，可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白，这些肽段可以作为侯选药物进行开发[14]。

目前该技术己广泛用于癌症、艾滋病、心血管病、组织器官移植、神经性疾病等领域药物的研究和开发，并己筛选出大量的受体领顽物、酶抑制剂等。

[15]五、噬菌体防治噬菌体既可以用作一些疾病的防治，同时它也是一些疾病的病原菌，以下列出了两种生活种常见工业中噬菌体的防治措施。

1. 发酵工业中噬菌体的防治为了防止噬菌体的污染，必须对种子、发酵液、空气以及周围环境定时进行检测，为防范噬菌体污染提供依据。

保持生产区的清洁，疏通排污系统，消除死角。

要做好废气、废液、废料的处理。

经常利用物理、化学消毒剂对环境消毒。

室内消毒可采用新洁尔灭(0. 05%)、甲醛(0. 1%)、高锰酸钾(0.05%)、来苏儿((0.5%)；室外消毒可采用漂白粉((0. 5%，按有效氯计)、生石灰(0. 1%,或洒干粉)。

对因噬菌体严重污染而要倒罐的发酵液，倒罐前必须进行认真地灭菌处理。