SILAC定量技术方案一样品制备1.细胞培养和蛋白提取(1).MEM培养基的准备(配制400mL)①制备氨基酸储液：分别在20mL L-Arginine缺陷型MEM培养基中配置0.30mM(50%正常浓度)的13C6L-Arginine hydrochloride和13C6,15N4L-Arginine hydrochloride储存液(均称取26mg)，待充分溶解后，分别用0.22μm的无菌滤器过滤。

②分别加入20mL除菌后的氨基酸储液、10%的透析胎牛血清、1%的青链霉素、2mM的L-Glutamine和2mM的丙酮酸钠并用缺陷型MEM培养基定容到400mL，贮存于4°C。

每种完全培养基中的氨基酸浓度见表4-1：表4-1MEM培养基中轻、中、重L-Arginine的浓度Cell lines Amino Acids M. W.Culture Media Amount(concentration)A L-Arginine174.2RPMI1640241.9mg/L(1.15mM)B13C6L-Arginine216.7MEM65.0mg/L(0.3mM) C13C6,15N4L-Arginine220.7MEM65.0mg/L (0.3mM)(2).细胞培养将A、B、C三种细胞复苏后，分别接种于10cm培养皿中，在常规RPMI1640培养基(添加10%的透析胎牛血清和1%的青链霉素)中培养HL-7702，分别使用仅含有13C6L-Arginine hydrochloride和13C6,15N4L-Arginine hydrochloride的MEM培养基培养B和C，经过5-6个细胞世代的培养后，将细胞数量扩增到107-108左右(5-6盘)。

(3).蛋白提取用500μl全细胞裂解液(50mM Tris，pH7.4；150mM NaCl；1%Triton-100；1mM AEBSF；20μl/μg aprotinin；20μl/μg leupeptin)2.蛋白质含量测定(1).采用改进的Bradford法，将BSA分别稀释为从0-1.40mg/ml范围内若干浓度，待测样品稀释10倍、20倍，各取20μL加80μL0.12M HCl，轻轻混匀。

(2).各管再加入3.5ml过滤的稀释4倍的dye reagent，轻轻混匀，静置5min后测A595值。

(3).取A595值对BSA标准浓度作标准曲线，再根据待测样品的A595值，从BSA标准曲线中确定其浓度。

(4).同位素标记样品与非标记样品按照蛋白含量1:1混合。

3.SDS-PAGE分离和染色(1).电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶;(2).2×SDS上样缓冲液的配制：2mL Tris-HCL buffer(0.5M,pH6.8)；2mL甘油；1mL巯基乙醇；4mL10%SDS溶液；适量水补足体积至10mL，混匀即得。

(3).电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶，先恒流10mA，运行时间0.5h，再于20mA运行至溴酚蓝前沿到达分离胶底部。

(4).胶体考马斯亮蓝染色方法如下：用10%甲醇，7%乙酸溶液固定30min，然后用胶体考马斯亮蓝溶液(0.12%G-250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇)染色过夜，用蒸馏水或10%甲醇水溶液脱色，清洗胶数遍即可获得背景清晰的染色效果。

4.胶内酶解、肽段提取(1).用干净的解剖刀将胶按照从高分子量到低分子量全覆盖切成3-4mm宽度的胶条，大约切成20个条带左右。

然后将每个胶条切成1-2mm2大小的胶块。

(2).100μL50%乙腈/25mmol/L碳酸氢氨浸泡胶粒，超声10min，弃去溶液，重复1-2次至胶粒的蓝色褪尽。

(3).真空离心干燥至胶粒完全脱水，加入10-15μl10ng/μL的胰蛋白酶(25mmol/L碳酸氢铵溶解），4°C冰箱放置30-40min，吸走多余酶液或补充25mM碳酸氢铵覆盖胶粒，37°C保温18-20小时。

(4).80-100μl5%TFA40°C提取1h，期间超声两次，取出上清。

80-100μl2.5%TFA/50%ACN30°C提取1h，期间超声两次，合并上清，离心干燥。

二质谱分析与数据库检索1.LC-LTQ-FT分析1).毛细管色谱系统在Agillent1100系统上进行，由自动上样器上样，上样体积为30μl，上样流速为10μl/min；色谱洗脱在由二元泵系统上进行，洗脱下来的组份经过ESI离子源直接进入质谱，液相色谱条件为：流动相A：0.1%FA-98%水溶液；流动相B：0.1%FA-80%ACN溶液。

洗脱条件：0-90min，流动相比例由2%B 线性升至40%B；90-105min，流动相比例由40%B线性升至100%B；维持15min 后，以100%流动相A平衡色谱柱30min。

流动相流速为300nL/min。

2).质谱仪为线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-FT，Thermo Finnigan)，磁场强度为7特斯拉。

雾化N2气流速(sheath gas)12L/min；碰撞气为高纯氩气；喷雾电压(spray voltage)为3.2kV；毛细管温度(capillary temperature)为160°C；毛细管电压(capillary voltage)为2.8kV。

分析柱为PicoFrit TM反相柱(BioBasic C18,5μm,75μm i.d.x10cm,15μm i.d.spray tip,New Objective,Woburn,MA,USA)。

一级质谱的数据依赖的二级质谱扫描模式(Data Dependent MS/MS Scan)；依次选取一级质谱中离子强度最强的5个离子进行CID二级串联质谱。

采用串联质谱扫描的动态排除功能(dynamic exclusion)，设置排除时间为3min。

离子自动增益控制设置为：一级质谱扫描为5×105个电荷，二级串联质谱为1×104个电荷。

一级质谱的在m/z为400处的分辨率为100000。

离子传输毛细管温度为200°C；从电喷雾电压1.8KV。

二级串联质谱母离子窗口为4Da，归一化碰撞能量为35%；质谱的一级全扫描质荷比范围是400－2000(Mass range，m/z400-2000)。

三．数据库检索1.应用DTA supercharge将raw文件转成mgf文件(1).DTAsupercharge软件可以从网上下载,,网站定期有版本更新。

(2).安装前需要安装Xcalibur，Bioworks，不同版本的DTAsupercharge对Xcalibur的版本要求不同。

安装时若版本不符会有提示。

安装Xcalibur时要安装XDK功能，见下图A.还需要 Framework的支持（1.1或2.0，不同版本要求不同）B.功能：把raw文件提出dta文件再合并成mgf文件。

C.界面如下：(3).转换单个raw文件：DTA processing标签下，选择raw文件。

然后点“Convert”菜单下的“Start Conversion”(4).批量转换：把指定文件夹下所有的raw文件进行转换：automation菜单下选择“set parameters for processing several raw files”设定这些raw文件所在的文件夹。

然后点“process raw files in folder”这样会把指定文件夹下所有的raw文件转换成dta和mgf文件。

2.Mascot搜库使用Mascot检索合并好的mgf文件。

设置检索参数：(1).所用数据库；(2).可变修饰设置为半胱氨酸烷基化修饰(+57.0214Da)，甲硫氨酸(Met)氧化(+15.99Da)，13C6L-Arginine修饰(+6.02Da)，13C6,15N4L-Arginine修饰(+10.01Da)。

(即将SILAC同位素的修饰设置为可变修饰)(3).最大胰酶漏切位点为1个，一级母离子误差20ppm，二级碎片离子误差0.8Da。

(4).将搜库的网页结果以peptide summary的方式保存。

(5).这样每个mgf文件就得到1个html格式的搜库结果。

四．数据定量分析1.Mascot检索后的肽段定量分析是由MSQuant完成。

2.软件在/，网站定期更新，可下载最新版本。

3.软件安装与datasupercharge一样，需要在装Xcalibur时安装XDK功能，还需要 Framework的支持。

4.软件在使用时，将raw文件与其相对应的Mascot搜索结果html文件相关联(associated)。

5.MSQuant定量软件的参数设置主界面示意图如下：肽段 Mascot 打分卡值蛋白 Mascot 打分卡值SILAC 标记模式定量形式(一般用 full scan 定量)肽段定量结果设置 SILAC 定量分析的参数：主要是设置肽段 mascot 打分卡值；SILAC 定量标记同位素氨基酸模式；以及定量形式(定量形式一般采用 full scan 定量的形式)。

设置完定量参数后可以进行定量分析了。

6.定量分析主界面如下：保留时间及峰强度定量质谱图重构色谱图在定量软件结果的基础上需要作手工校正，即对主界面上肽段定量结果SD偏差大的肽段定量结果进行手工检查和修正，A.检查定量肽段的质谱峰有没有指认错误；B去掉定量偏差大的个别错误定量结果；C.如果一个蛋白有多个肽段定量，个别定量结果偏离太大的可以去除。

下图是肽段的具体参数(包括打分和修饰形式)以及肽段的 MS/MS 图谱：7.定量的结果 Msquant 可以以 excel 的形式输出。