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• 二..原理 • 是以抑制PCR为基础的DNA差减杂交。抑 制PCR．是利用DNA链内退火优于链间退 火，比链间退火更稳定的特点，使非目的 系列片段两端反向重复系列在退火时产生 类似于“锅一柄”的结构，无法与引物配 对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩 增。同时，该方法运用了杂交二级动力学 原理，即高丰度的单链cDNA在退火时产生 同源杂交的速度要快于低丰度的单链cDNA， 从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相 对含量达到基本一致。
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第三章 发育生物学研究技术和 方法
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• 在第一章回顾发育生物学的历史时，我们已了解 了实验技术对发育生物学发展的突出贡献，特别 是分子生物学的兴起给发育生物学的发展所带来 的活力。事实上，发育生物学是一门实验性很强 的学科，很多重要的发育理论和发育模型都是在 大量实验结果的基础上建立起来的。其中涉及各 种各样的研究技术和方法，既有传统的胚胎学和 细胞学方法，如胚胎移植、胚胎分割、细胞核移 植等，又有新发展的分子生物学方法，如显微注 射、原位杂交,基因转移及基因功能分析等。本章 将重点介绍发育生物学研究中的几种常用方法 ‘
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• 第一节 显微注射 • 显微注射(microinj ection)是发育生物学研 究中最经典而又使用最为普遍的一种方法， 特别是近十几年来通过基因转移创造生物 反应器这一具有明显商业价值的应用研究 的开展，更显现出这一技术的活力。本节 将介绍显微操作系统、注射用卵子或胚胎 的准备、操作过程等。
• 全胚原位杂交的基本原理: • 是用各种标记物标记与体内特定mRNA互 补的RNA分子(反义RNA)，以它们作为探 针与动物的整体胚胎进行原位杂交，然后 用相应的抗体来检测特异探针的分布情况。 以下以爪蟾胚胎为例介绍全胚原位杂交的 操作步骤。其他动物的全胚原位杂交与爪 蟾基本相同。
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• 二、显微注射步骤 • 1．注射用卵母细胞的制备 • 在鱼类和两栖类动物中，卵母细胞可采用两种方 法获得，一是将动物麻醉后，通过解剖取出卵巢 叶(两栖动物)，或用挖卵器从泄殖孔取出所需要 的卵母细胞；另一种方法是杀死动物，取出全部 卵巢。对哺乳动物而言，一般通过超数排卵 (superovulation)获得更多的卵母细胞，即模拟体 内卵母细胞发育与排放的激素调节模式，通过注 射不同的促性腺激素，刺激暂时处于休眠状态的 卵母细胞进入成熟发育期，成熟后排放到输卵管 中。由此可以获得的卵母细胞远多于自然排卵。 下面以两栖动物爪蟾为例，简要介绍制备卵母细 胞的这两种方法的基本步骤。
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• 二．胚胎组织切片原位杂交 • 原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法。 虽然全胚原位杂交简单易行，但在许多情 况下，该方法还达不到研究的要求，因而 需要在胚胎的组织切片上进行杂交。在胚 胎的组织切片上杂交的有利因素在于不存 在探针不能渗入到胚胎内部的问题。
显性突变
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从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
突变类型图示
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从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
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(一)单色全胚原位杂交 1．原位杂交试剂 2．操作步骤 (1)探针制备 (2)胚胎的固定与保存 (3)原位杂交 (4)洗脱和检测
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(二)双色全胚荧光原位杂交
• 用2种不同的标记物(DIG-11-dUTP，生物 素一11一dUTP等)分别标记2个探针，同时 与胚胎杂交，然后对两个探针分别用相应 的抗体进行检测。 • 在双色全胚原位杂交中，探针的制备、胚 胎的固定杂交及洗脱方法与单色原位杂交 步骤相同，只是检测方法有所不同。
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• •
核糖核酸酶保护实验的基本原理是： 将待分析的目标DNA．序列作为模板，用逆转 录的方法合成与之互补的放射性标记的探针。 将此探针加入到RNA混合物中后，它便可与目 标RNA杂交，形成双链RNA。由于该双链对 核糖核酸酶具有抵抗力，因此，杂交体系中未 杂交的样品RNA．及过量的探针全部被核糖核 酸酶消化，只剩下杂交形成的双链RNA。核糖 核酸酶失活后，通过凝胶电泳和放射自显影检 测被保护的RNA探针的量，即RNA样品中目 标RNA的量。
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第四节发育基因的启动子分析
• 一。用途 • 启动子调控作用分析是研究胚胎发育基因 功能的一种重要方法，特别在研究基因时 空表达的分子机制方面，更是有突出的作 用。通常，启动子分析包括基因特异调控 序列、启动子(promoter)和增强子元件 (enhancer element)的鉴别，它们都是基因转 录活性的重要调控单元。
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• 有多种方法可用于体内(in vivo)启动子分析， 如转基因动物、显微注射等，在不同的动 物中可选用不同的方法，但比较而言，转 基因动物法较为费时，而且需要一些特殊 条件，而显微注射法较为简单。本节将以 斑马鱼胚胎中goosecoid基因启动子分析为 例介绍启动子的定性和定量分析方法。
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• 一．显微操作系统 • 显微操作系统已经历了多次更新和发展。现今 普遍使用的显微操作器一般由带荧光或相差的倒 置显微镜、显微操作臂、注射器及玻璃微吸管、， 摄像装置和计算机图像处理装置等组成。为了配 制一个性能优良的用于发育生物学研究的显微操 作系统，虽有许多必须考虑的因素，但由于现在 普遍采用的显微操作系统一般都是配套购置，且 都具有详细的说明书，因而这里就不详述。有兴 趣者还可参考有关文献。
(一)、鉴定发育相关新基因的主要方法
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发
育的基因；
分离时空特异性表达基因的方法；
利用基因序列同源性的克隆法； 利用生物大分子间的相互作用克隆新的
基因。
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从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
突变体的类型
隐性突变； 半显性突变；
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第六节 抑制性差减杂交技术
• 一.应用： 抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)最早见。1996年6 月Clontech公司、加州大学旧金山分校和俄罗斯 科学院合作的研究报道(Diatchenko et a1 .996)， 是一种简便而高效的通过比较两种总mRNA，而 克隆只存在于其中一种总mRNA中特异表达产物 的新方法。例如可以快速从不同细胞系、不同组 织间或同一细胞系、同一组织在不同条件下(如发 育时间的差异、病理性差异等)克隆出差别表达基 因。
• 一．全胚原位杂交 • 全胚原位杂交(whole mount insuite hybridization，WISH)是广泛用于胚胎发育 调控基因表达研究的一种技术。近年来该 技术发展较快，不仅可以检测到较弱的杂 交信号，而且可以多色杂交，检测多个基 因的表达情况。
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• 2．分散囊胚细胞中的启动子分析 • 3．完整胚胎中启动子的定量分析 • 4．整体胚胎中启动子空间活性分析
Developmental Bi 分析
• 一应用：核糖核酸酶(RNase)保护实验是 定量分析基因转录水平的常用方法之一， 它对mRNA的分析具有灵敏度高(比 Northern杂交和点杂交灵敏8～10倍)、 特异性强的特点。另外，核糖核酸酶保 护实验还可用于转录起始位点的确定、 内含子／外显子边界的确定、选择性剪 接(alternative splicing)分析及确定转入 到胚胎中的核酸的降解率等方面的研究。
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第三节 胚胎免疫组织化学技术
• 一．用途：胚胎免疫组织化学是定位胚胎 内的内源或外源蛋白质的一种有效方法。 该技术操作相对简单，如果和其他一些免 疫学技术结合使用，可以快速获得相关蛋 白质功能的有关信息。
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• 二．胚胎免疫组织化学技术的基本原理： • 是用某种蛋白质免疫其他动物(通常为鼠或 兔)而获得相应的抗体(初级抗体)，再用初 级抗体免疫另一种动物，获得次级抗体。 在次级抗体上偶联上一种酶(如碱性磷酸化 酶)，构成免疫复合物。将胚胎与初级抗体 结合后，洗去多余的抗体，再与免疫复合 物结合。最后利用显色反应来确定胚lift内 特定蛋白质的表达位置。本节以爪蟾胚胎 为例介绍胚胎蛋白质免疫组织化学检测的 操作方法。
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• 三.SSH基本过程是： • 抽提2种不同细胞如肿瘤细胞和正常细胞的mRNA分别作 为检测样本(tester)和参照样本(driver)，反转录成cDNA．， 用Rsa I或．Hae III酶切，以产生大小适当的平头末端 cDNA片段，将‘tester cDNA分成均等的2份，各自接上2 种接头，与过量的driver cDNA变性后退火杂交。第一次 杂交后有4种产物： (a)testercDNA．，(b)自身退火的 tester cDNA双链，(c)是tester和driver的异源双链，(d)是 driver cDNA。第一次杂交的目的是实现。tester单链 cDNA均等化(normalization)，即使原来有丰度差别的单 链cDNA．的相对含量达到基本一致，由于tester cDNA中 与drivercDNA。序列相似的片段大都和driver cDNA形成 异源双链分子(c)，使tester cDNA．中的差异表达基因的 目标cDNA得到大量富集。第一次杂交后，合并2份杂交产 物，再加上新的变性driver单链，再次退火杂交，此时， 只有第一次杂交后经均等化和扣除的单链tester cDNA和 driver cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富 集了差异表达基因的cDNA，产生了一种新的双链分子(e)， 它的2个5’端有2个不同的接头，正由于这2个不同的接头， 使其在以后的PCR中被有效地扩增(图3—3)。