讨论
ＡＰＭ】是单拷贝基因，长约１７ ｋｂ，由３个外显子 和２个内含子组成。３个外显子分别长１８、２２２和 ４ ２７７ ｂｐ，其上含有可识别的剪切位点；２个内含子分 别长约０．８和１２ ｋｂ。人体内的脂联素由２４４个氨基 酸组成，相对分子质量为３０ ０００，共有３个区域：氨基 端信号肽序列（ａａ ｌ—１８）、胶原样结构域（ａａ １９—１０７）和 羧基末端的球形结构域（ａａ １０８—２４４）。人脂联素基因 定位于３ｑ２７，全基因组扫描显示该区域存在２型糖尿 病和代谢综合征的易感位点，也是冠状动脉疾病的候 选位点。脂联素的水平降低与多种动脉硬化相关性疾 病或综合征有关，如糖尿病、血脂紊乱、内皮细胞功能 障碍、高血压和肥胖。２型糖尿病患者血中脂联素水 平低于有动脉粥样硬化危险的因素（如肥胖、高血压、 年龄、家族史、吸烟、脂代谢紊乱）但未患糖尿病的患 者。控制良好的糖尿病患者血中脂联素水平高于控制 不佳的患者，因此，脂联素可作为具有动脉粥样硬化高 危险因素的患者代谢控制的一个指标。７１。
图１
Ｆｉｇ ｌ
质粒与插入片段连接处的测序图谱
Ｐａｒｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐＣＤＥＦ—ＡＰＭｌ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
六、ｐＣＤＥＦ－ＡＰＭｌ转染ＨＥＫ２９３细胞 用含１０％ＦＢｓ的ＤＭＥＭ高糖培养基培养ＨＥＫ２９３ 细胞，让其生长良好。按１×１０５个细胞／孑Ｌ接种于无 菌６孑Ｌ板中，在转染前１ ｄ换液，加入２ ｍｌ培养基，待 细胞生长至６０％～７０％融合时。按试剂盒推荐的优 化条件进行转染，２４ ｈ后加入２ ｍ１培养基（含Ｏ．５％ ＦＢｓ），４８ ｈ后检测转染效率，收集细胞上清。 七、ＥＬＩＳＡ法检测脂联素表达水平
ｇｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃＴＣＡＧ’Ｉ丫ＦＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧ—
ｃＣＴ。以ｐＧＥＭ—Ｔ—ＡＰＭｌ质粒为模板进行ＰｃＲ反应， 目标产物为两端带有Ｓ６ Ｉ酶切位点的全长型人脂联 素基因。反应体系（５０¨１）：１０×缓冲液（５斗１）；４× ｄＮＴＰ（２卜Ｌ１）；ａｍｐｌｆ（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）２斗ｌ；ａｍｐｌ ｒ（１０斗ｍｏＬ／ Ｌ）２斗ｌ；ｄｄＨ２０ ３８．５斗ｌ；模板５０ ｎｇ；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶５ ｕ。反应条件：９５℃预变性５ ｍｉｎ；然后９５℃变性３０ ｓ， ５８℃退火４５ ｓ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，反应２５个循环；最后 ７２℃再延伸ｌｏ ｍｉｎ。ＰｃＲ产物经１．ｏ％琼脂糖凝胶电 泳分析后，用ＰＣＲ纯化试剂盒进行纯化、回收。
结果
用所设计合成的一对引物从质粒ｐＧＥＭ．Ｔ·ＡＰＭｌ 上成功扩增出７５０ ｂｐ左右的两端带有ｓ６ Ｉ酶切位点 的ＡＰＭｌ片段，与理论值相符。ＰｃＲ产物用ＰｃＲ纯化
万方数据
图３ ｐＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ转染ＨＥｌ（２９３细胞（生长良好） Ｆｉｇ ３ ＨＥＩ（２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｃＤＥＦ／ＡＰＭｌ（ｇｒｏｗ ｗｅｌｌ）
ＤＮＡ ｒｅｃｏＨ幽ｎ粕ｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｘｐ陀ｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＤＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ
ｉｎｔｏ ＨＥＫ２９３ ｃｅｕｓ
ｒｅａ鼯ｎｔ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｈｕＩｎａｎ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｍ砒ａｎｔ ｏｆ ｃｅＵ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ
基金项目：国家自然科学基金（３０３７０６７０，３００７０３５６） 作者单位：４０００１６重庆医科大学附属第一医院 通讯作者：邓华聪，Ｅｍａｉｌ：ｄｅ“ｇ－ｈｕａｃｏｎｇ＠ｙ８Ｉ１００．ｃｏｍ．ｃｎ
材料和方法
一、主要试剂 ｐＧＥＭ—Ｔ－ＡＰＭｌ质粒的构建由本课题组完成，测序 结果与ＧｅｎＢａｎｋ发表的资料一致；ＤＨ５仪菌和ＨＥＩ（２９３ 细胞由第三军医大学野战外科研究所七室保存。ＰＣＲ 引物（Ｔａｋａｒａ）；Ｔ载体和ＰＣＲ酶（Ｐｒｏｍｅｇａ）；胶回收试 剂盒（ＱＩＡＧＥＮ）；Ｓｆｉ Ｉ限制性内切酶（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；快速连接试剂盒（Ｆｅｎｎｅｎｔａｓ）；胎牛血清 （ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）；ＤＭＥＭ高糖培养基（Ｇｉｂｃｏ）；高纯度质 粒抽提试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＰｃＲ产物纯化试剂盒 （Ｏｍｅｇａ）；转染试剂（ＱＩＡＧＥＮ）；人脂联素ＥＬＩＳＡ检测 试剂盒（Ｒ＆Ｄ）；ｐＣＤＥＦ质粒（上海交通大学生命科学 技术学院）；序列分析（上海鼎安生物科技有限公司）。 二、ＰＣＲ扩增ＡＰＭｌ
三、ＰＣＲ产物亚克隆到Ｔ载体 将纯化的ＰＣＲ产物与Ｔ载体用快速连接试剂盒
试剂盒纯化后，连接到Ｔ载体，通过蓝白斑筛选出阳 性克隆。含有ＡＰＭｌ的Ｔ载体和空载体ｐｃＤＥＦ一起 用ｓ６ Ｉ酶切后获得７５０ ｂｐ左右的ＡＰＭｌ片段和大于 ５ ｋｂ左右的ｐＣＤＥＦ片段，与理论值相符。挑取的４个 克隆抽提质粒后，ＰｃＲ均扩增出７５０ ｂｐ左右的ＡＰＭｌ 片段，与理论值相符，而对照质粒则只扩增出了引物二 聚体，提示挑取的４个克隆均为阳性克隆。双向测序 结果表明送测的两个质粒序列完全正确，与ＧｅｎＢａｎｋ 报道的ＡＰＭｌ（ＧＩ：８７１８８６）序列一致，质粒与插入片段 连接处的测序图谱见图ｌ，显示阅读框正确。
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·基础研究·
人脂联素基因真核表达载体的构建 及在ＨＥＫ２９３细胞中的表达
李丙蓉邓华聪 兰丽珍郑宏庭刘金波
【摘要】 目的构建人脂联素（ＡＰＭｌ）基因真核表达载体，并检测其在ＨＥｌ（２９３细胞中的表达水平。 方法用ＰｃＲ法从测序正确的ｐＧＥＭ—Ｔ．ＡＰＭｌ质粒上，扩增出两端带有踮Ｉ酶切位点的人脂联素基因， 再将扩增出的片段亚克隆到Ｔ载体上，用踮Ｉ酶切Ｔ载体和ｐｃＤＥＦ空载体，将酶切后的片段进行连接、 转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的ｐｃＤＥＦ—ＡＰＭｌ质粒转染ＨＥＫ２９３细胞，ＥｕｓＡ检测培养上清中脂联 素的水平。结果 构建的ｐｃＤＥＦ．ＡＰＭｌ质粒能有效转染ＨＥＫ２９３细胞，并在培养上清中检测到较高水平 的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在ＨＥＫ２９３细胞中获得高效表达。
哺乳动物的脂联素一旦合成，经过翻译后羟基化 和糖基化修饰形成８种亚型。其中６种亚型是糖基化 的，胶原结构域内的６８、７ｌ、８０和１０４位的赖氨酸残 基，９４位的脯氨酸残基是氧连接的糖基化位点¨ｏ。糖 基化的脂联素作为胰岛素增敏剂的效应远远强于细菌 合成的非糖基化的脂联素，提示脂联素翻译后的修饰 对其发挥最佳的生物学活性是必需的。由于哺乳动物 细胞可以对表达的真核蛋白进行翻译后加工修饰，包 括：二硫键形成，多聚化，蛋白酶加工，适当的糖基化以 及在分子伴侣的作用下正确折叠。因而，构建真核表 达载体，并在真核系统中表达人脂联素蛋白，将为进行 脂联素蛋白的纯化、鉴定和制备，以及鉴定单克隆抗体 和进行脂联素的功能研究奠定基础。
ｔｍｎｓｆｅｃｔｅｄ’１，ｉｔｈ ｐＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ；ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ；Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｕｓ
（劬ｉｎ．，Ｅ蒯。硎加Ｚ胁￡０６。２００６．２２：４６４＿４６６）
２９３ ｃｅＵｓ
Ⅱ
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【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ７ｒｏ ｃ０Ｉｌｓｔｍｃｔ ａｎ ｅｕｋ８ｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍ蛐８ｄｉｐｏｓｅ ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ
用蹦ｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计两端带有ｓ６ Ｉ酶
万方数据
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切位点的ＡＰＭｌ上下游引物：印ｍｌｆ：ｇｅｇｇｃｃａａｔｃｃｇｇｃ—
ｃＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＴＧＣ；ａｐｍ １ ｒ： ｃｇ—
进行连接，取连接反应产物３斗ｌ转化感受态细胞 ＤＨ５仪，并和ＩＰＴＧ、ｘ—Ｇａｌ一起混合涂布在氨苄青霉素 抗性的ＬＢ平板上，３７℃培养过夜。分别挑５个白色 单菌落到５支５ ｍ１氨苄青霉素抗性的培养管中３７℃ 摇床过夜培养。用０ｍｅｇａ质粒抽提试剂盒提取质粒。
四、酶切、连接 含有ＡＰＭｌ的Ｔ载体和载体ｐｃＤＥＦ一起用ｓｆｉ Ｉ 酶切。电泳后用ＱＩＡＧＥＮ胶回收试剂盒回收ＡＰＭｌ和 ｐｃＤＥＦ载体，连接并转化到ＤＨ５仅感受态细胞涂板 （氨苄青霉素抗性）培养。 五、特异性ＰＣＲ鉴定阳性克隆 挑取４个克隆和一个阴性对照克隆（来源于载体 自连板），加入ＬＢ培养基培养。用基因特异的５’端引 物和载体特异的３ ７端引物ＰｃＲ鉴定挑取的克隆。取 其中两个阳性克隆抽提质粒送测序。
【关键词】脂联素；克隆，分子；基因表达；真核细胞
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ｏｆ Ａ肼Ｍ１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒ鹤ｓｉｏｎ
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ＨＥＫ２９３细胞的转染效率约为６０％，对照质粒转 染ＨＥＫ２９３细胞后表达荧光蛋白的情况见图２。 ｐｃＤＥＦ—ＡＰＭｌ转染ＨＥＫ２９３细胞后，细胞生长良好，见 图３。
ＥＬＩｓＡ法检测结果显示，转染真核表达载体 ｐｃＤＥＦ／ＡＰＭｌ的ＨＥＫ２９３细胞上清液中人脂联素蛋 白质浓度为（１５０±１２）¨∥Ｌ，而其余对照组均未检测 到脂联素蛋白。
Ｆｉｇ ２
图２表达ＧＦＰ的对照质粒转染ＨＥｌ＜２９３细胞