（三）操作步骤：
1、菌株活化: 在无菌操作下 (1). 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之 前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻 触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完 全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央 轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3培养基为止 （I 区）。 (2). 旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未 接种的区域（II 区）。 (3).重复步骤(2)的动作完成 III 区与 IV 区 (4). 灼烧接种环，将接种环归位。 (5)将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。
• 1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上， 使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的 营养丰富些。
保藏斜面
→
活化斜面
2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良 的生产性能。 保藏斜面 → 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） →活化斜面
六 实验步骤
（一）实验所需物品： • 1.仪器：霉菌培养箱、恒温摇床 • 2.玻璃器皿：50ml三角瓶、9cm培养皿。 • 3试剂：丙三醇（甘油）、胰蛋白胨、 酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、 卡那霉素。 • 4.其他：移液枪、枪头、1.5ml离心管。
液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期 稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备 的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一 综合性表解，以便读后有一全面了解。
1、斜面保藏法和穿刺保藏法
（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面 接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃
图示: A、金属接种环
B、平板划线法
2、菌种保存：在无菌操作下 (1)挑取活化所得的菌板上的单个菌斑培养， 用3ml液体LB培养基（卡那或氨苄抗性） 在7ml离心管内，37度摇床培养过夜。 (2)用移液枪吸取得到的一定浑浊度的菌液 800微升和200微升丙三醇加入1.5ml离心 管中，混匀。-80度保存。
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃），
3.注意事项：
(1).用移液枪时枪杆千万不要触碰器皿内壁， 触碰会引起不必要的污染。 (2)吸取液体时千万不要将液体吸入移液枪 内，万一吸入不要将液体再打回器皿内， 应丢弃。更换移液枪或控干移液枪，然 后在使用。 (3)画板时动作要快且轻柔。动作太重会将 培养皿中的培养基划破，不利于菌生长。 动作太慢会有沉降菌进入培养皿中，引 起不必要的污染。
（二）实验准备工作： 1、配制LB培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 固体培养基需加入琼脂粉18g（夏季）或 15g（冬季），高压灭菌，备用。 2、将培养皿、锥形瓶、枪头、离心管等高压 灭菌。 3、氨苄青霉素、卡那霉素过滤除菌分装放在 1.5ml离心管内，—20℃保存。 4、
故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
5.悬液保藏法（略） 6.低温保藏法
四、菌种保藏的共同注意点
• 1、严格的无菌操作； • 2、用于保存的微生物在生长前必须处于 它生长良好的状态； • 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同 的保藏方法，分别有不同的保存时间。）
五、与菌种保藏相关的几个概念
菌种保藏及活化
菌种保藏的原理和方法
一、菌种保藏的目的Leabharlann 保存、不退化二、菌种保藏的原理
DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代 谢不活泼的状态 。
休眠态（孢子、芽孢）
代谢不活泼的状态
环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法和穿刺保藏法
沙土管干燥保藏法
真空冷冻干燥保藏法
Thanks
冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）。保存期一 般为3~6月。 注意点： （1）水分：用牛皮纸避免水分蒸发，或用橡皮塞 （2）培养基：专门设计的培养基，营养相对不太丰富 （3）微生物状态：孢子或芽孢长好后，再保藏，不易退化
（4）温度：4℃冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目 的）
（2）穿刺保藏法： （略）