细胞融合技术姓名：王洋专业：生物化学与分子生物学学号：3117107细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。

细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。

随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。

1细胞融合及其意义1.1细胞融合的概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。

如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。

体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞,由此形成的杂交细胞,其特性会有很大的变化。

1.2细胞融合的机理最近研究表明 ,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处 ,即带包被的病毒 (或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。

I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素( HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白 ,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。

病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程 (伴随有构象的变化)的。

细胞内的膜泡融合也是如此 ,其相关融合蛋白包括 GTPases 及SNARE家族。

因此推测细胞融合采用相似的机理。

然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构 ,提示a-螺旋并非融合所必需。

1.3细胞融合的意义细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。

它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。

但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。

细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视。

2细胞融合技术发展的回顾人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合。

随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。

自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。

原生质体的大量制备技术限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。

直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。

然而,由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物质PEG,作为病毒的替代物诱导细胞融合,这是一个里程碑式的发现,引起实验生物学的“无声革命”。

但在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%-55%)对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG介导细胞融合法,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术等。

总之,细胞融合技术在实践中不断发展和完善,细胞融合方法得到了不断的更新和改进,融合率也得到逐步的提高。

现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。

2.1动物细胞融合一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。

1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。

当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。

他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。

1967年Weise 和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。

1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。

从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。

然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。

2.2植物细胞融合植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。

但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。

直到1960年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。

1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。

20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。

2.3微生物细胞融合1975年原生质体融合技术已扩展运用到微生物中,匈牙利的Ferenczy 首先报道PEG促使真菌融合,以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。

3细胞融合的方法3 .1化学法3.1.1 盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。

盐类融合剂对原生质体的破坏小。

今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

3.1.2高钙和高 pH值融合法Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。

Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。

提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

3.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)加拿大籍华人高国楠 (1974)用聚乙二醇 ( PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合。

此法比病毒更易制备和控制 ,活性稳定 ,用 PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。

在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内 ( 50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。

聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。

放线菌适用分子质量常为1 ku～1.5 ku,也有人使用0.4 ku～6 ku,真菌一般采用4 ku～6 ku,细菌用1.5 ku～6 ku。

亲本原生质体制备好后,即可进行融合。

关于促融机制,一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。

在Ca2+存在下,引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到两个原生质体全部融合。

3.2物理法3.2 .1电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于 20世纪 80年代 ,目前已成为细胞融合的有效手段之一。

该技术融合效率高 ,是 PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害 ,可在显微镜下观察融合全过程。

这一技术将电学与生物化学恰当结合,产生了缓和而高频率的原生质体融合效果。

其原理是在短时间强电场的作用下,细胞膜发生可逆性电击穿,瞬时失去其高电阻和低通透性,然后在数分钟内恢复原状,当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时,即可诱导它们的膜相互融合,从而导致细胞融合。

近年来,该技术在微生物中的应用日渐增多。

3.2.2激光融合技术20世纪80年代中期发明了激光融合器,迅速崛起的激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动),可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。

即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。

这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞。

1987年和1989年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产物观测,发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活。

激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌,无毒性。

但它只能逐一处理细胞,不能像其他方法一样同时处理大量细胞。

细胞间相互接触是实现细胞融合的前提,目前,最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触,即光镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间,在光斑直径与光波波长尺度相比拟时,指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力,该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处,从而实现对细胞的操作。

植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在,有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大,异源细胞融合得率十分有限。

在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。

20世纪80年代以来,德国细胞电融合技术发明家Zmi mermann等人在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。

大量的飞行实验结果表明,在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。

融合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故,杂种细胞活力增加可能是细胞排列时间缩短引起的。

在取得这些成功实验的基础上,进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经开始。

3.2.4离子束细胞融合技术中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。