4 . 内生放线菌
植物内生放线菌有根部结瘤的弗兰克 氏菌（Frankia），一个放线菌新属 （Actinosynemma）。玉米根叶中分离出放 线菌主要为小双孢菌、链霉菌和链孢囊菌。 链霉菌最多(n=482)，链轮丝菌(n=2), 诺卡 氏菌(n=4),小单孢菌(n=1) 链孢囊(n=1)。
4 . 内生菌放线菌的分离

心叶烟种子由实验室提供。

烟草种植：先在盆中垫好筛过的细土，把适量烟草种子与细土混匀，均匀洒在土壤表面，并在盆底下垫上大盘，从大盘中把水浇透，盖上纱网即可；

烟草移植：一盆一株，先在小花盆中装入适量筛过的细土，盆底小孔处垫上小石块等物，再把烟草从大盆中挖出，注意根部带土，移入小花盆中，把土压实，
并在盆底下垫上大盘，从大盘中把水浇透，盖上纱网即可。
4 . 内生菌的分离
植物组织内部表面消毒方法包括用次 氯酸钠、环氧丙烷气、过氧乙酸、升汞、硝 酸银等消毒剂清洗，还有人用乙醇烧或者直

内生放线菌的选择性分离主要通过在植物材料表面消
毒后，使用不同的培养基和在培养基中添加不同的抗生素
来实现。这些选择剂的添加是必要的。因为内生真菌的生
长一般比内生放线菌快，容易在分离培养皿中过量生长，

1.2.1 实验准备

培养皿清洗，包皿；培养基配制，分装

灭菌：干热灭菌（160℃～170℃，1～2h，不能超过180℃）包括：培养皿，研钵，石英砂，滤纸等；

高压蒸汽灭菌（0.1Mpa,121℃,30min）包括：培养基，无菌水，移液枪枪头

倒平板：遵循稳，轻，快原则倒皿，置于28℃条件下培养三天，无菌生长方可使用
萄糖10.0 g，琼脂 18.0～20.0 g, 蒸馏水 1000.0 ml。以上不加琼脂即 为肉汁胨液体培养基。 b. 采用PDA培养基分离真菌
c采用高氏1号培养基、YCED 培养基、YCED 培养基初筛固体培养 基TWYE 培养基YIM-2 培养基HVA 培养基分离放线菌。初筛培养基抑制 剂浓度为每L 培养基中含有250U 的链霉素和50mg 的重铬酸钾。
2．分离方法: ⑴内生细菌 表面灭菌: 将块茎用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用
75%的乙醇和次氯酸钠（有效cl-10%）分别进行表面消毒五分钟， 再用无菌水漂洗块茎三次。为了检验表面灭菌的效果，用灭菌过的 镊子夹住块茎,使其表面与固体平板接触3～5 min，然后将培养皿 放在22℃～25℃的温箱中培养3～5d。若发现皿中无菌落出现，证 明该块茎表明灭菌彻底，否则，该分离结果不能使用。 ⑵取样: 用打孔器（d＝10 mm）从茎基部插入薯块，取出样品， 用灭菌的手术刀切取10 mm（包括维管束环），置于研钵中(De Boer,1974)。 ⑶样品处理: 研磨样品，加无菌水定容至10ｍl，静置30 min后，梯 度稀释到浓度为10-1～10-4，取0.2ml涂布于BPA平板上，每浓度 涂平皿一个，重复三次，置于２２℃～２５℃温箱中培养。 ⑷纯化和保存: 培养3～5d后，挑取不同形态的菌落重新于固体平 板上划线纯化，然后，真空冷冻干燥保存，备用。
根、马铃薯的块茎、种子和胚珠、棉花的胚根、 棉铃和水稻叶子及其它植物储藏器官内分离到大 量内生细菌 。 2. 皿内筛选靶标菌
苹果腐烂病菌、小麦全蚀病菌、油菜菌核病 菌、猕猴桃溃疡病菌等30多种真菌和细菌。 3. 生测及防病试验
小麦白粉病、小麦条锈病、小麦纹枯病、油 菜菌核病、西葫芦白粉病、苹果腐烂病等。
1.小麦内生菌
菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用
菌株的革兰氏染色情况（G-）
2.黄瓜内生菌
分 离 病菌 菌株 的对 抑棉 制花 效枯 果萎
分 离 菌病 株菌 对的 苹抑 果制 腐效 烂果
菌株对苹果腐烂病菌的抑制效果
菌株对小麦赤霉病菌的抑制效果
菌株对苹果腐烂病菌液培菌丝生长的抑制作用
(上方: 对照 下方: 三次重复)
基平板上,同上第四次无菌水涂抹平板做对照。27 ℃黑暗培养,细菌培养3～7天后，放线菌培养7～14天后，若相应对照无污染，则可根据菌落形态、颜色等挑
取单菌落,纯化后保存于斜面中。

2 抗病毒活性分析及筛选

将内生菌进行液体培养，提取上清液，而后采用半叶法在心叶烟寄主上进行治疗试验测定其相对防治率，初步筛选出一部分有较好抗病毒活性的菌株。
菌水涂抹平板做对照。3－7天后，可见断面边缘长出菌丝。若相应对照无污染，则可挑取前端菌丝转入分离培养基。采用此方法，不断对分离得到的菌株进
行纯化，纯化好后保存在斜面中漆茎、叶、花、根样品各1.5g，每样品加10ml 无菌水碾碎静置15min 后,各取80μl涂在牛肉蛋白胨培养基、高氏一号培养
实验七 内生菌的分离、鉴定
一 、实验的目
本实验以植物组织为材料从中分离内生菌， 其目的是筛选活性内生菌菌株，掌握鉴定种类、 液体培养、次生代谢产物提取和活性测定的方法， 为生物防治提供优良菌株材料。

植物内生菌次生代谢产物的多样性为人类突
破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制，
利用植物内生菌工业发酵生产重要的药物开辟了
子型
表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布更容易浸润到要灭菌的材料 表面
蔬菜内生放线菌的分离和生物活性，加吐温或Triton X 后灭菌剂活力 大为提高所以在清洗液中加入了Triton-100表面消毒的检验将表面消 毒后的组织块在培养基表面滚动并轻轻印记取出组织块用玻璃涂棒涂 布均匀在培养箱内28 下培养36 天 取无病株或种子，先用水冲洗干净，然后在0.1%十二烷基苯磺酸钠 中浸泡30min，再用水冲洗干净，然后随机称取根、茎、叶各5g，纱 布包裹，以下工作在超净工作台上进行。包裹好的材料浸入0.1%的 HgCl2中消毒18min，再用无菌水冲洗3～4次。

2.2 抗病毒活性分析
四、实验方法
1. 材料的表面消毒。 方法1 用75%乙醇浸泡3min 然后用0.1%HgCl2 中浸泡15min 无菌水磁 力搅拌下浸洗5 次每次5min 以上所有清洗溶液中均加入1 Triton-100。 方法2 用75%乙醇浸泡3min 然后20% NaClO 中浸泡5 min 无菌水磁力 搅拌下浸洗5 次每次5min 以上所有清洗溶剂中均加入1 Triton-100 近年来普遍提倡在灭菌溶液中加添吐温-80 或Triton X 这是一些非离

材料与方法

1 内生菌的分离与纯化

1.1 供试材料

供试植物：采集于陕西不同地区处于生长期的泽漆健康植株。

供试培养基：

（1）牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水 1000mL，琼脂15g，pH 7.2～7.4）；

（2）PDA 培养基（葡萄糖 20g，马铃薯 200g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL）；
丝在宿主植物的叶鞘和种子中含量最多， 而叶片和根中含量极少。
三、实验材料
1. 植物
黄瓜(Cucumis sativus) 、甘蓝 (Brassica0leracea)、百慕大草(Bermuda grass)的茎、小麦、番茄、辣椒、油菜、杂草， 花生(Archis hypogaea)果仁、已从黄瓜、甜菜
泽漆、大戟 不同部分内生菌分离纯化
活性菌株
发酵液和菌丝体
抗病毒活性测定
提取物生物活性测
活性最高的菌株
菌株鉴定
活性成分分离
活性成分鉴定
1. 供试品种 采集不同地区、不同品种的苗期、开花期、
荚果膨大期的无病株和种子。采集新鲜材料后立即使用。 2. 分离培养基
a. 采用牛肉膏蛋白胨固体培养基、肉汁胨培养基(BPA)分离细菌 肉汁胨培养基(BPA)：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母膏1.0 g，葡
图13 E1R-J 菌株对小麦全蚀病的防治效果
左: 健康对照 中: 喷菌悬液 右: 发病对照

（3）高氏 1 号培养基（可溶性淀粉 20g，KNO3 1.0g ，K2HPO4 0.5g ，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水 1000mL，琼脂 15g，pH 7.2～7.4）。

分别用于内生细菌、内生真菌和内生放线菌的分离培养。

1.2 分离与纯化

真菌采用组织分离法，细菌及放线菌采用稀释涂抹法进行分离，分离出后挑取形态颜色相似的菌落，纯化后于斜面中保存备用。
表面消毒效果的常用检验方法：有两种。
(1) 漂洗液检验法，即把最后一次漂洗灭菌材料的漂洗液吸取0.2～0.3ml涂布 于固体平板上。每个处理重复3次，培养48h，观察有无菌落产生。
(2) 组织印迹法，即把经灭菌、无菌水漂洗过的材料置于固体平板上保留几分 钟，然后移去样品。于28℃培养48小时，检查表面消毒是否彻底。据此验证此 消毒方法是否能全部杀死供试材料。表面消毒检验方法的评价标准为表面消毒 检验培养皿中菌落数量越多菌落出现的时间越早说明该表面消毒检验方法的灵 敏度越高
选择性培养基主要是以淀粉为碳源，酪蛋白为氮源，加以
制霉菌素、放线菌酮等抗真菌化合物以促进放线菌的生长，
但是多数研究是为了了解内生放线菌的群落生态组成因此
只选用一种或几种分离培养基，干热等用于提高土壤中放
线菌分离数量，预处理方法也可以用于植物组织。
内生放线菌的分离 弗兰克氏放线菌的离体培养非常困难，主要原因在于： （1）一般离体培养需要2～3 周或更长时间 （2）土壤中含有快生型的微生物如细菌腐生放线菌或真菌
菌株放线菌的菌丝形态光镜照片
3.产酶内生菌
菌株对油菜菌核病菌的抑制效果
菌株对油菜菌核病菌菌丝的影响
菌株产β-1,3葡聚糖酶的皿内情况
菌株对油菜菌核病菌的抑制效果
二、植物内生菌的活体测定