C. 延伸的温度与时间
温度取决于DNA聚合酶的最适温度，时间和待扩增片段长度有关（72℃）
D. 循环数
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度（30-40次）
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02 基本实验步骤
PCR产物检测
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶板的制备(1.5%)
加样电泳（电压80V、时间2hr）
紫外
EB，它能和碱基间的氢键结合，在 波长为254nm~365nm的紫外光照射下 呈橘红色（530nm）的荧光
熔解曲线 确认PCR反应的特异性。
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Real Time qPCR
相对定量法分析结果
内参/管家基因 GAPDH、β-actin、18S rRNA、ACTB、β2M......（至少选择两个以上）
核酸表达量计算
R =2−ΔΔCt
例：
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PCR
谢谢观看
Thanks
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耐高温，在热变性时不会被钝化
使DNA聚合酶具有催化活性
包括Tris-HCl（维持PH值），KCl（利于引物的数设置
A. 变性的温度与时间
温度取决于DNA模板及PCR产物的G+C含量，时间取决于DNA的长度（95℃）
B. 退火的温度与时间
温度取决于引物的G+C含量及引物的长度，退火时间不是关键因素，但也应该加以控制（60℃）
形 成
DNA 2
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~35轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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02 基本实验步骤
核酸模板 引物
4种dNTP
Taq DNA聚合酶
Mg2+ 反应缓冲系统
DNA/RNA，线性，小片段模板，核酸样品应除去存在对DNA聚合酶有抑制作用的有机溶剂和金属 离子 PCR的特异性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5µM；Tm值；4种碱基随机分布；自身避免反向重 复序列；引物之间不存在互补序列；3’端选择保守的氨基酸序列；与非特异性序列的同源性） PCR的合成原料，四种dNTP浓度应相等
PCR
多聚酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
.
01 原理
以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板互补的 寡核苷酸片段为引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照 半保留复制的机理沿着模 板链延伸直至完成新的DNA 合成
.
01 原理
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
荧光探针法
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Real Time qPCR
基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环
里，荧光信号变化不大，接近一条直线，
这样的直线即基线。
。
光阈值（threshold）
一般将PCR反应前15个循环的荧光信
号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR
3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧
光域值设定在PCR扩增的指数期
.
03 衍生PCR技术
原位PCR
逆转录PCR
PCR技术
定量PCR
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巢式PCR 多重PCR
逆转录 PCR
相对于基本PCR，在开始阶段增加步骤：RNA →cDNA合成，是单链到双链的过程。
引物 逆转录酶
RNA水解酶
.
Real Time qPCR
荧光嵌合法(TB Green™)
实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应 体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
Ct (Cycle threshold)值
表示每个PCR反应管内荧光信号到达
设定的域值时所经历的循环数 .
Real Time qPCR
Ct值无数值（undetected） 阴性
Ct值≤30.0 阳性
Ct值>30.0 表达量极少
固定循环数后，荧光信号与模板数成正比。 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少。 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。