DASL Assay
• 实验原理
上下游引物间延伸
PCR扩增1536倍
纯化探针
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DASL Assay
• 实验原理
芯片杂交、染色
DASL Assay
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纯化cDNA双链
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Direct Hybridization assay • 实验原理
体外转录RNA
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Direct Hybridization assay • 实验原理
Direct Hybridization assay • 实验结果
分析结果
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Illumina ’s Replication Test Illumina’
• 解码程序
Decoder Oligo Decode hyb 1 Decode hyb 2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
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解码程序
• 确定微珠所携带的核苷酸 (颜色)步骤 = 微珠类型
– –
DASL Assay
• 实验结果
聚类分析
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DASL Assay
• 实验结果:
比较分析
Bibikova, M., et al (2004). Quantitative gene expression profiling in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues using Universal Bead Arrays. Am J of Pathol 165, 1799-1807.
提取RNA 合成cDNA
总RNA电泳图
纯化cDNA
合成cRNA
纯化cRNA
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mRNA电泳图
Direct Hybridization assay • 实验步骤
cRNA定量
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Direct Hybridization assay • 实验结果
扫描结果
•
Image of one BeadArrayTM bundle
•
Enlarged view—each bright spot is a bead with fluorescent signal
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• 全基因组DASL分析芯片
• 癌基因DASL芯片 96样本，502个癌 基因 • 定制DASL芯片
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Illumina microRNA芯片
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microRNA简介
microRNA芯片检测原理
microRNA芯片检测流程
(4 色)2 步 = 16 种微珠 (4 色)8 步 = 65,536 种微珠 定位并确定亮度
• 微珠的质量检验
– –
荧光筛选不能检测出的微珠被剔除 • 测定芯片上所有微珠 – 每个芯片都会有解码CD
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发表文章
• 1) Cokus SJ, Feng S, Zhang XY, et al. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning, 2008, Nature, 452:215-219 • 2) Lin SM, Du P, Huber W, et al. Model-based variancestabilizing transformation for Illumina microarray data, 2008, Nucleic Acids Research, 36(2): e11 - e11 • 3) Stranger BE, Forrest MS, Dunning M, et al. Relative Impact of Nucleotide and Copy Number Variation on Gene Expression Phenotypes, 2007, Science, 315: 848-853 • 4) Teo YY, Inouye M, Small KS, et al. A genotype calling algorithm for the Illumina BeadArray platform, 2007, Bioinformatics, 23(20):2741-2746 • 5) Eisenstein M. Microarrays: Quality control, 2006, Nature, 442:1067-1070
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基因芯片合成
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各基因芯片比较
• 与其他芯片相比，微珠法合成的芯片密度更高，表面积更小，样本需 要量更小，成本更低廉。
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’s Replication Test Berkeley Biotech Biotech’
芯片序列号：1922146025 芯片类型：Human Whole Genome Expression v6.0 样本标记重复（技术重复）： A\B\C\E(左)：平均R2=0.993017 D\F(右)：R2=0.9943
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DASL Assay
• 芯片质量
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DASL Assay
• 和定量PCR相比较
r2=0.87
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纯化cRNA
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Direct Hybridization assay
• 实验原理
芯片杂交、荧光染色
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Direct Hybridization assay • 实验步骤
去除RNA
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Direct Hybridization assay • 实验原理
合成cDNA二链
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Direct Hybridization assay • 实验原理
• 部分降解的 mRNA分析 • DASL Assay
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DASL Assay
• cDNA-mediated Annealing, Selection, extension, and Ligation (DASL) • 既可以用于分析完整RNA也可以用于被甲 醛固定石蜡包埋的人体组织中已部分降解 的mRNA • 可分析保存超过12年的样品
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Illumina芯片分类
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表达谱芯片
microRNA芯片
SNP芯片
甲基化芯片
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Illumina表达谱芯片
表达谱芯片
• 完整mRNA分 析 • Direct Hybridization assay
Illumina基因芯片的合成
�每个微珠上覆盖一种基因 �微珠池中装有成百上前个 微珠 �微珠随机装配到面板上形 成微阵列 �保证微阵列中每个微珠有 30个重复 �用解码程序来确定每个微 珠中所包含的基因序列
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Illumina基因芯片的合成
BPS
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Illumina基因芯片技术简介
/ Phone: 021-34315602 Email：bpsbiopharm@
基因芯片简介
• 基因芯片
基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray) 技术将 高密度 DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方 式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等 固相表面，以荧光标记的 DNA 探针，借助碱基互补 杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究 的最新革命性技术。
• 部分降解的 mRNA分析 • DASL Assay
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Direct Hybridization assay
• 实验原理
逆转录
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Direct Hybridization assay • 实验原理
Direct Hybridization assay • 实验步骤
芯片封闭
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Direct Hybridization assay • 实验步骤
荧光染色
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MicroRNA简介
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Illumina表达谱芯片
表达谱芯片
• 完整mRNA分 析 • Direct Hybridization assay
Direct Hybridization assay • 实验步骤
芯片杂交
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Direct Hybridization assay • 实验步骤
芯片洗脱
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DASL Assay
• 实验原理
100ng完整RNA或200ng部分降解RNA
用Oligo（dT）和随机引物逆转录
mRNA特异引物和cDNA退火