脂肪 Zuk, 2001, 2002；Sen, 2001；Von Heimburg D, 2001
神经 Safford, 2004；Ashjian, 2003；Rchman, 2004；杨立业, 2003, 2004
多向分化潜能
脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性 诱导因子作用下进行的。
下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导 后的细胞特性。
脂肪间充质干细胞
Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells
汇报提纲
一. 研究背景 二. 脂肪干细胞优点及表面标记 三. 多向分化潜能 四. 猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系 五. 应用前景及待解决的问题
一、研究背景
动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和 赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细 胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致 肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化 的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之 一。
脂肪间充质 干细胞优点
最后，从经济和社会效益看，从脂肪组织中获 取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪，如临床上 脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的 内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源，具有极大的 经济与社会效益。
表面标记
关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标 准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干 细胞均表达CD44、CD105、STRO-1、CD166及 CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体，在全 能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。
成肌诱导后的形态学观察
A
B
C
D
成肌诱导
成肌诱导第7天出现细胞球形变化(A)，诱导第14天开始出现接 触、融合。部分出现伪足，形态变长(B)，诱导第21天周围梭形细 胞明显减少，形成巨大的球形细胞(C,D)。上图为茜素红染色。
免疫荧光染色
成肌诱导
成肌诱导后肌红蛋白(myoglobin)免疫荧光染色
成肌诱导第14天，可检测到肌红蛋白(myoglobin)的表 达(图A)，第21天表达明显增加（图B)。
肌细胞标志基因mRNA的表达
成肌诱导
β-actin 399 bp MyoD 243 bp Myf5 154bp
RT-PCR 检测成肌标志基因的表达 1为对照，2为Myf5(成肌调节因子)，3为MyoD(生肌决定因子)
但若将该细胞应用于临床，仍需在动物模型上进行 大量安全性和有效性的实验。尽管AMSCs实际应用过程 中仍存在一些需要解决的问题，如体外培养是一种优化 过的环境，而体外培养后的AMSCs能否适应体内环境而 继续生长分化；在体内AMSCs分化控制过程中能否排除 致瘤性风险及是否发生免疫紊乱等。
RT-PCR检测标志基因mRNA的表达
成骨诱导
β－actin OCN 165bp
COL-1 539bp β－actin
RT-PCR检测成骨标志基因COL- 1 （Ⅰ型骨胶原）及OCN（骨钙素）表达 M: marker; 1-4分别为第0天，7天，14天，21天OCN的表达; 5-8为COL- 1的 表达。
CD90、和HLA-ABC
DR
三、多向分化潜能
多向分化潜能
近几年的研究结果表明，在合适诱导剂下，脂 肪间充质干细胞和骨髓干细胞一样，可向脂肪、软 骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞 等方向分化。
多向分化潜能
Strem BM, 2005
分化 方向
骨骼肌
相关文献
Mizuno, 2002；Bacou, 2004；陈希平, 2004
AMSCs的表面标记
CD44+ (×50)
CD105+ (×100)
CD14– (×50)
CD34– (×100)
CD106– (×100)
HLA-DR– (×50)
利用免疫组织化学方法检测猪AMSCs特异性表面标记，结果： CD44和CD105呈阳性。CD14，CD34,CD106,HLA-DR均为阴性。
24代细胞表面marker鉴定
CD105＋
CD44＋
目前我们正在对保存的细胞进行染色体核 型分析，支元体检测等工作。
五、AMSC应用前景及待解决的问题
现有的研究表明，脂肪组织是一个易获取和储量丰富的成体 干细胞库。AMSCs取材容易，创伤小，具有可控制的多向分化能 力，对于组织工程来说，几乎是个“完美”的细胞；且细胞培养、 扩增较容易，易获得大量可供自体或异体移植使用的干细胞；在 急、慢性骨、软骨组织损伤，肌组织缺损、矫形手术、中枢神经 系统损伤及其它领域有潜在应用价值。
细胞类型
诱导物
细胞特性
脂肪细胞 地塞米松,异丁基甲基黄 细胞中充满脂滴，油红o染色
嘌，胰岛素等
阳性
成骨细胞 2-磷酸抗坏血酸, β-甘油 钙化性基质产物 ，茜素红染
磷酸 ，地塞米松等
色阳性
骨骼肌细胞 地塞米松，氢化可的松， 多核形态，骨骼肌肌性素重
或5-氮杂胞苷
链/MyoD表达
心肌细胞 5-氮杂胞苷
AMSCs的培养特性
A
B
细胞培养7-8 天后，细胞生长即可达80 %-90 %融合，贴壁细 胞紧密排列成漩涡状、网状、辐射状，有一定的方向性，集落大小 不一，含数个至数百个细胞不等；集落中细胞形态为典型梭形细胞 (图A)，这就是我们所要分离获得的猪AMSCs。原代培养14 d 左右 即可形成致密单层(图B)。
背景知识
2001年 Zuk等首次从病人脂肪组织悬液中分离获 得了有多向分化能力的细胞，并将其命名为抽脂处理细 胞（PLA）。PLA在特异性诱导剂下可分化为成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。之后，多个研究小组 相继证实，脂肪组织中确实存在着与骨髓间充质干细胞 相似的成体干细胞。脂肪间充质干细胞的发现进一步拓 宽了脂肪组织领域的研究。
14
诱导天数
AMSCs成脂诱导后第2天可以检测到脂肪细胞标志基因PPARγ的 表达,且随着诱导时间的增加,其表达水平也增加。
成脂诱导
由上述结果可以看出，猪脂肪间充质干细胞在地塞 米松、胰岛素、吲哚美辛等的诱导作用下，细胞形态发 生变化，由长梭形变为充满脂滴的脂肪细胞。油红O染色 和 RT-PCR均表明可以诱导分化脂肪细胞。
心肌 成骨 软骨
Rangappa, 2003；Planat-Benard, 2004；Yamada, 2006(棕 色脂肪组织)；张端珍, 2005；王燕, 2005
Zuk, 2001, 2002；Halvorsen, 2000；Hattori, 2004； 陈希哲, 2004
Huang, 2004；Winter, 2003；严笠, 2005
STRO-1
CD13、CD29、CD44、 CD105、CD71、STRO-1
CD14、CD16、CD31、 CD34、CD45、CD106、
CD56
CD13、CD29、CD44、 CD105、CD90、STRO-1
CD49d、CD54、CD34、 CD106
CD10、CD13、CD29、CD44、CD11b、CD45和HLA-
表面标记
除了上述几种标记外，脂肪间充质干细胞也表 达其他多种分子标记，包括CD29（β1-整合素，在血 管发生治疗中起重要作用）、CD44（透明质酸盐） 和CD49e（α5 -整合素，在细胞粘附纤连蛋白中起重 要作用）等。
表面标记
不同研究组对脂肪间充质干细胞表面标记的鉴 定结果并不完全一致，如Gronthos等发现AMSCs不 表达STRO-1，但Zuk等发现表达STRO-1。这些不一 致的结果可能与细胞所处状态及纯度有关。
细胞圆形，α-肌动蛋白和肌 钙蛋白-I表达
神经元细胞 β-巯基乙醇或者异丁基甲 细胞缩小、周围有多个神经
基黄嘌, 消炎痛等
突起
内皮细胞 血管内皮细胞生长因子， 细胞之间形成网格样结构 ， 碱性成纤维细胞生长因子 表达内皮细胞特异性抗原
肝(实质)细 肝细胞生长因子， 抑瘤 表达白蛋白和 α-胎蛋白
胞
素M
因此，AMSCs细胞系的建立可为研究脂肪细胞分化 全过程，探讨脂肪细胞分化早期细胞与分子事件提供新的 研究模型。
本实验室在成功分离猪原代AMSC细胞后，细胞单克 隆扩增方法获得单一来源的AMSC细胞，传20代后细胞形 态一致，经鉴定仍然具有AMSC表面标志。
细胞单克隆扩增培养
所有细胞均来源于同一祖细胞，细胞形态一致
结果：在成骨诱导分化的早期（第7天），可检测到成骨特 异性基因Ⅰ型骨胶原和骨钙素的表达，随着诱导时间的增加，2 个基因的表达量呈上升趋势。
成骨诱导
上述结果说明：在合适诱导剂下，猪脂肪 间充质干细胞形态和排列均发生变化，成纤维 样的长梭形变为成骨样的方块形，细胞堆积呈 卵圆形或方形，茜素红染色和 RT-PCR均表明 可以诱导分化成骨细胞。
其次，脂肪组织比骨髓中所含干细胞比率大。 通 过成纤维细胞集落形成单位比较脂肪组织显示，成人 骨髓来源细胞中成纤维细胞集落形成单位出现频率为 1/50000～1/1000000，而当脂肪组织用胶原酶消化， 除去上层漂浮的成熟脂肪细胞，下层细胞中成纤维细 胞集落形成单位的频率为1/100，说明脂肪组织中干细 胞数目至少是骨髓的500多倍 。
表面标记
报道文献
Gronthos， 2001
Zuk，2002
De Ugarte， 2003
Aust，2004
AMSCs表面标记
阳性
阴性
CD44、CD49d、CD49e、 CD54、CD55、CD59、 CD105、CD106和HLA-ABC
CD14、CD45、CD50、 CD56、HLA-DR和骨髓 基质细胞表面分子
肝实质细胞
在2006年4月第16卷4期的自然科学进展上，裴雪涛 等人发表的文章《人脂肪来源的干细胞体外培养特性及 分化为肝细胞样细胞的研究》。