ADSC s 的分离与纯化

关于ADSCS勺获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂

肪干细胞， 是一组具有干细胞特性的细胞群。 目前应用最广泛的分离

方法是酶胶原消化法。 首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小 的颗粒，PBS夜冲洗干净后，用0. 1%的胶原酶在37C下振荡消化 48

90mi n,再用含10%胎牛血清的等体积 DME培养基终止。1200r /min离心5~10min,弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过 细胞筛过滤，所得细胞按2—4X 105/cm接种于50ml培养瓶内。37C 条件5%的CO饱和湿度培养箱内培养，2d后首次换液，以后3d换液 一次，至细胞达70%〜8O%融合时用0. 25%胰酶消化，并传代。经 过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁 生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小， 核浆比较大,随后细胞体积渐增大,克隆形成。经传代后,细胞的形 态及排列才趋于一致。 由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性 的分子标记物, 因此无法利用分子表型来分离纯化。 然而可通过纯化 脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显 示：传至第 3 代时,可达 95%以上的细胞纯度。

ADSCS勺生物学特性 ADSC s 的分离与纯化

1. ADSCS的鉴定

在ADSCS鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式 细胞术检测结果均显示 ADSCs表达特异性分子CD44 OCT一 4，E—

eadherin ，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期 的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体 核型分析显示ADSC具有遗传稳定性。

ADSC分泌多种生长因子

在生理功能方面， 脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子， 包括肝细 胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）胎盘生长因子（PGF）、 转化生长因子一 B（TGF- B）、成纤维细胞生长因子（FGF一 2）等，低 表达的因子有 Ang 一 2C。

2. ADSCS的多向分化能力

与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩 增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导 剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗 等领域有着潜在价值。

向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、

吲哚美辛及1 一甲基一 3〜异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCS向脂 肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记： 脂蛋 白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白 aP2、 PPAR—r2、 leptin（ 瘦素）、 Glut4（ 葡 萄糖转运蛋白等。 镜下观察可见胞内有空泡形成。 这些特点是脂

肪细 胞形成的标志。

向血管内皮细胞分化：将ADSC置于含甲基纤维素和血管内皮生长因 子的半固体培养基中加以培养，镜下可见有分支状的管腔结构形成， 免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记一 CD31和 vW因子。

Planat等描述了将培养3d的ADSC注入后肢缺血损伤的实验小鼠后 肢肌肉中，15d以后给以血管造影及多普勒检查发现损伤后肢血供出 现显着改善的实验结果。

向成骨细胞分化:h — ADSC在加入维生素C B一磷酸甘油(BGP)和维 生素D3的培养基中培养几代后，细胞表面形成的突起，其形态与体 内的成骨细胞相似，用茜素红染色可见细胞内出现了钙小结”。国外 有将ADSCS乍为种子细胞植入网状支架中，成功地修复狗的颅骨的报 导。国内马舟涌等将获得的脂肪干细胞和进行成骨诱导后的脂肪干细 胞分别种植在复合骨形态发生蛋白和纤维蛋白胶支架上， 并移植到骨 缺损模型中。

实验证明， 经诱导后的脂肪干细胞在复合骨形态发生蛋 白和纤维蛋白胶支架中可以促进骨骼愈合。 这也间接证明了 ADSC啲 确向成骨细胞分化。

向软骨细胞分化：在体外，将维生素 C转化生长因子(TFG)、胰岛 素添加到特定培养基里，可以定向诱导AD-SCs向软骨细胞分化。结 果在培养基里形成了细胞小结， 经免疫组化分析得知， 这些细胞小结 表达H型胶原纤维、硫酸软骨素、硫酸角质素等。杨亚军等用 CDMPI

体外诱导 sD 大鼠脂肪干细胞，结果诱导后的脂肪干细胞形态由长梭 型向

软骨细胞的多角形方向转变。免疫组化显示 CDMP诱导大鼠

ADSC后可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖（GAG）和H型胶原，并进

一步向软骨细胞方向分化增殖。

向心肌细胞分化：从脂肪组织中分离的脂肪基质血管组分

（stromalvascularfraction , SVF）即脂肪组织去除成熟脂肪细胞后， 所获得的具有于细胞特性的基质细胞， 直接种植在半固体的甲基纤维 素培养基中，6d后，出现了各种不同的细胞形态，有成群的前脂肪 细胞／脂肪细胞，成纤维样细胞等等， 11—14d 后，一些圆形的细胞 开始了独立的收缩活动，在几天内，肌管样结构出现，并大量生长增 殖， 20—30d

后，局部出现了一簇有结合力的细胞群体，和有分支的 纤维细胞共同结合在一起。在这期间，24d时，整个局部出现了单一 节律的搏动。 在分子水平上， 这些搏动的细胞能表达几种心脏特有的 mRNA如转录因子，GATA一 4和Nkx2. 5,心室和心房肌凝蛋白轻链 MLC一 2v和MLC一

2a,以及ANP（心钠素）。这些数据表明了这些搏 动细胞的心肌细胞特性。

向神经细胞方向分化：国外一些研究人员用 B一巯基乙醇（B —

mercaptoethanol , B— ME诱导 h—ADSCS向神经细胞分化，30min 后

即出现类神经元样的细胞, 3h 后出现了神经元细胞表型,表达神经 细胞早期阶段的标志性因子 nest in、NSE NeuN等，这证明了 ADSCs 能在体外分化为神经前体细胞， 目前技术水平尚不能使之向成熟的神 经元细胞或星型胶质细胞分化。

ADSCS勺临床应用前景展望

1. 在组织工程中的应用

应用组织工程有两种方案， 一种是将种子细胞在体外接种于支架 上培养，然后再进行移植； 一种是将种子细胞与可降解材料复合物直 接移植到体内诱导目标组织形成。 目前脂肪干细胞应用于临床仍处于 动物实验阶段。有报道利用脂肪干细胞和支架成功地修复了骨缺损模 型中犬勺骨缺损。

脂肪干细胞在修补受损伤勺组织时与体外生物 I 型胶原支架材料勺 相容脂肪干细胞具有增殖能力和多向分化潜能。 对多种组织勺损伤具 有良好勺修复作用。而且取材方便 , 是组织工程研究中勺重要种子细 胞之一。不同材料对细胞勺生长、分化和黏附均有不同勺影响 , 因而 种子细胞能否在支架材料上良好生长 , 并表达自身特异性功能是目前 组织工程研究勺一个热点。

I 型胶原支架材料与脂肪干细胞具有良好勺体外生物相容性，而且具 有对细胞、组织等无毒性；不影响生物体勺生长、增殖等功能。有实 验表明用体外生物 I 型胶原支架材料与脂肪干细胞进行体外混合培 养，证明了脂肪干细胞能在 I 型胶原支架材料上良好勺附着、生长、 增殖并在三维支架材料内保持均匀分布。 故 I 型胶原支架可作为构建 脂肪组织工程的细胞载体。 I 型胶原作为体外细胞培养支架时 . 有促 进细胞粘附和诱导生长分化的作用， 是良好的培养粘附剂。 其降解产 物可被细胞利用合成新的基质。 不产生毒性代谢产物， 不影响内环境 pH值，因此不会影响细胞的

生长增殖。胶原蛋白及相关制品已广泛 应用于临床医学中，已被美国FDA批匕准作为人工皮肤材料。 研究利用人脂肪干细胞作为种子细胞 ,

进行体外细胞种植胶原支架。 通过倒置显微镜和电镜观察细胞伸展、黏附和生长过程。镜下显示 , 种子细胞种植胶原材料后 ,生长状态良好 , 无明显细胞毒性表现 ,在培 养条件相对稳定的情况下 . 细胞可以进行正常增殖、迁移并分泌细胞 外基质。通过检测 .细胞与支架的黏附率达 97%以上。说明该支架对 细胞有良好的亲和性。

脂肪干细胞在骨组织中的应用 骨外伤、骨肿瘤和先天性畸形患者中常存在大面积的骨缺损。 而修复 材料的匮乏一直是临床面临的难题之一。 传统骨修复的材料， 如肋骨 和髂嵴等自体骨，可获取的组织量有限。且对取材部位造成损伤：磷 灰石和去矿化异体骨等异体材料， 存在免疫排斥、

疾病传染及骨溶解 等问题。近年来， 干细胞和骨组织工程研究的不断深人，为临床骨缺 损的修复提供了新思路。 脂肪干胞 (Adipose —derivedstemcell,A DSC) 由于来源丰富且容易获取， 体内、外实验均证实其能分化形成骨样组 织，已成为骨组织工程的重要的种子细胞来源。而外国人

Friedenstein 将骨祖细胞分为确定性骨祖细胞

(determinedosteogenicprecursorcells,DOPC) 和诱导性骨祖细胞

(inducibleosteogenicprecursorcells , IOPC),确定性骨祖细胞是

间充质细胞不能自发向成骨细胞转化，在一定的诱导因素后 , 才能向 成骨细胞转化。 由于脂肪干细胞来源稳定且含量丰富， 在体内不经基 因修饰

或外源性生长因子刺激也能修复骨缺损， 这使它在未来组织工 程骨修复临床骨缺损的应用中备受关注。 但目前对脂肪干细胞参与修 复骨缺损的机制尚不清楚。 研究表明间充质干细胞随着传代次数的增 多而逐渐丧失其多向分化潜能。向脂肪细胞的分化能力只能维系 10 代以内，以后向成软骨细胞、神经星状细胞分化的功能相继丧失，但 是体外培养的间充质干细胞向成骨细胞的分化能力可维持 20 代以 上，有研究证实不同种属间间充质干细胞可能有差异因此今后的研究 需要深入了解脂肪干细胞在局部骨缺损修复中的作用， 并寻找最佳的 局部环境促进其成骨分化。 自然状态下， 体内调控干细胞成骨分化的 环境信号， 包括局部微环境内的细胞因子、 细胞与细胞或细胞与基质 的相互作用，以及机械应力等，在今后，对这些因素的更多发现，及 其对它们相互作用的更深入理解可能是体外条件下精确地调控脂肪 干细胞成骨分化的关键。 目前，已有应用自体脂肪干细胞修复大面积 颅颌面缺损的报道， 随着对脂肪干细胞成骨机制的了解， 相信脂肪干 细胞参与构建的组织工程化骨将会尽快地真正应用于临床大面积骨 缺损的修复。针对性别因素对脂肪干细胞分化影响的研究发现 , 雌性 动物的脂肪干细胞脂肪分化趋势较强 , 而雄性动物的脂肪干细胞更易 表达成骨标志物 , 这可能与激素促进了脂肪干细胞向脂肪细胞分化有

关。

与此相应,科学家研究发现 , 男性脂肪干细胞的成骨分化时间早于女 性,分化速度更快 ,分化效率也明显高于女性。目前 ,对胚胎期及出生 后骨发生分子机制的研究受到广泛关注 ,一些分化调控因子 , 如骨形 态发生蛋白骨髓的间充质干细胞家族等 , 被用来增强脂肪干细胞体 内、外的成骨分化能