按下表操作： 0 1 2 —— 0.20 5.0 3 —— 0.20 5.0 4 —— 0.20 5.0
生理盐水(ml) 生理盐水(ml) 0.20 —— 上述1~4管标 上述1~4管标 —— 0.20 准稀释液（ml) 准稀释液（ml) BCG应用液 BCG应用液 （ml) 5.0 5.0
实验试剂
1.溴甲酚绿（BCG）贮存液 1.溴甲酚绿（BCG）贮存液 取BCG 419mg，用10ml 419mg，用10ml 0.1mol/L NaOH溶解，加NaN3 100mg ，定容至1000mL。 NaOH溶解，加NaN3 ，定容至1000mL。 贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水 贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水 溶解。 2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.2）分别配制0.1mol/L柠 2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.2）分别配制0.1mol/L柠 檬酸和柠檬酸钠溶液，然后按12.3：7.7的体积比例混合。 檬酸和柠檬酸钠溶液，然后按12.3：7.7的体积比例混合。 每1000ml混合液加入NaN3 100mg。 1000ml混合液加入NaN3 100mg。 3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液 3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液 取Brij-35 30g,加 Brij- 30g,加 少量水，60℃水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween少量水，60℃水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20 或Tween-80代替)。 Tween-80代替) 4.BCG应用液 BCG贮存液250ml，0.1mol/L柠檬酸缓冲液 4.BCG应用液 BCG贮存液250ml，0.1mol/L柠檬酸缓冲液 （pH4.2)750ml,30%Brij-35 8ml(也可以用Tween-20 8ml pH4.2)750ml,30%Brij- 8ml(也可以用Tween或Tween-80 10ml代替）混合而成。 Tween- 10ml代替）混合而成。 5.标准蛋白溶液（10mg/ml) 称取人白蛋白1.00g，用生 5.标准蛋白溶液（10mg/ml) 称取人白蛋白1.00g，用生 理盐水
3.白蛋白/球蛋白比值（A/G比值） 用双缩脲法测定血清标本中的总蛋白浓度，用总蛋白浓度减去白蛋白浓度 即得球蛋白浓度，并可求的A/G比值：
A/G比值 比值= ————————————— 比值
白蛋白含量
总蛋白含量---白蛋白含量 总蛋白含量 白蛋白含量 参考值： 参考值：35~50g/L
【临床意义】 临床意义】 1．血清白蛋白浓度增高，常见于严生脱水所致的血浆浓 缩 2．血清白蛋白浓度降低 在临床上比较重要和常见，通 常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出 血和严重的烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿，肝功能损伤， 肠道肿瘤及结核病伴慢性出血，营养不良和恶性肿瘤等。 血清白蛋白低于20g/L。临床上出现水肿。 血清白蛋白低于20g/L。临床上出现水肿。 20g/L 3．A/G 某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的 现象，严重者比值可＜1。这种情况称为A/G比值倒置。 现象，严重者比值可＜1。这种情况称为A/G比值倒置。 4．文献报道还有极少见的因白蛋白合成障碍，血清中几 乎没有白蛋白的先天性白蛋白缺乏症。
实验八
溴甲酚绿法测定血清白蛋白
【目的要求】 目的要求】 1.溴甲酚绿法测定血清 1.溴甲酚绿法测定血清 白蛋白含量的实验原 理、关键技术和特点 意义。 2.熟悉稳定性试验的基 2.熟悉稳定性试验的基 本操作及意义
【实验原理】 实验原理】 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 在有非离子型表面活性剂存在时，可与带 负电荷的染料溴甲酚绿（BCG）结合形成蓝 负电荷的染料溴甲酚绿（BCG）结合形成蓝 绿色复合物，在波长630纳米处有光吸收峰， 绿色复合物，在波长630纳米处有光吸收峰， 其颜色的深浅与白蛋白浓度成正比，与同 样处理的白蛋白标准比较，可求得血清白 蛋白含量。
混合后以空白管校零，立即比色，比色波长为 620nm，以光密度为纵坐标，相应管中的白蛋白 620nm，以光密度为纵坐标，相应管中的白蛋白 浓度为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 血清白蛋白测定 用生理盐水按1：10的比例稀释血清，取稀释后的血清0.2ml 加入BCG应用液 5.0ml混匀后立即同上比色，读取光密度，并从标注曲线上 查出相应的白蛋白 浓度。
实验操作
1.白蛋白标准曲线绘制 1.白蛋白标准曲线绘制 取4支试管，按下表稀释标准液： 1 白蛋白标准液 （ml) 生理盐水(ml) 生理盐水(ml) 0.10 0.90 2 0.20 0.80 2.0 3 0.40 0.60 4.0 4 0.60 0.40 6.0
稀释后白蛋白 1.0 含量（mg/ml) 含量（mg/ml)
【方法评价】 方法评价】 1．本法操作简便、快速、胆红素、溶血和中度脂 血无干扰，既可手工操作，也能自动化分析，是 目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。 2．本法线性范围10-60g/L，RCV＜4%。但该法 ．本法线性范围10-60g/L，RCV＜4%。但该法 与溴甲酚紫法比较，对血清白蛋白特异性稍差。 3．血清白蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料 结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法。
【注意事项】 注意事项】 1．BCG是一种PH指示剂，变色域为PH3.8（显黄色）～5.4 BCG是一种PH指示剂，变色域为PH3.8（显黄色）～5.4 （显蓝绿色），因此控制反应液的PH是本法测定的关键。 （显蓝绿色），因此控制反应液的PH是本法测定的关键。 2．配制BCG试剂也可用其他缓冲液如枸椽酸盐或乳酸盐缓冲 ．配制BCG试剂也可用其他缓冲液如枸椽酸盐或乳酸盐缓冲 液。但以琥珀酸缓冲液的校正曲线通过原点，线性好，灵敏 度高，成为首选推荐配方。 3．试剂中的Brij-35也可用其他表面活性剂代替，如吐温20或 ．试剂中的Brij-35也可用其他表面活性剂代替，如吐温20或 吐温80，终浓度为2ml，灵敏度和线性范围不变。 吐温80，终浓度为2ml，灵敏度和线性范围不变。 4．当白蛋白标准与BCG结合后，溶液光径1，在630处测定的 ．当白蛋白标准与BCG结合后，溶液光径1，在630处测定的 吸光度应为0.811±0.035，如达不到此值，表示灵敏度较差。 吸光度应为0.811±0.035，如达不到此值，表示灵敏度较差。 5．蛋白质标准液是一个复杂的问题，实验证明，BCG不但与 ．蛋白质标准液是一个复杂的问题，实验证明，BCG不但与 白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以球 蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋 白稍慢。由于30S内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后， 白稍慢。由于30S内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后， 在30S内读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减 30S内读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减 少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。
【思考题】 思考题】 1．BCG法测定ALB的技术关键是什么？应 BCG法测定ALB的技术关键是什么？应 如何解决非特异性反应的问题。 2．简述稳定性实验的作法及意义。