结核杆菌特异抗原： •早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6， ESAT-6） •培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）
结核杆菌特异抗原
ESAT-6与CFP-10抗原
• 由结核杆菌基因组RD1 区相同的操纵子编码的 蛋白
肉汤
改良Middlebrook 7H9肉汤
传感器
对氧气高度敏感的钌复合物
O2 O2
O2
O2
O2 CO2
FFO2F
F F
F
F F FO2 F
无或微弱荧光
强荧光
MGIT /3D制造的液体培养基
优点
• 比固体培养快 (平均 10-12 天 vs. 20-24 天) • 比固体培养基更敏感 • 可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读 • 也加快了药敏试验的速度
局限
• 需要NALC-NaOH进行痰处理和离心 • 普通菌群的污染很常见 • 比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病） • 确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的
鉴定 • 比固体培养基昂贵
②血清学诊断
血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。 无需活细胞培养和特殊仪器设备 操作简便 结果显示快速 目前用于血清学诊断的主要方法: 酶联免疫吸附试验(ELlSA) 斑点金免疫渗滤法(DIGFA) 免疫印迹法(Western Blotting)等等
结核病的实验室诊断
主要内容
1 结核病的流行情况 32 结核病的病原学 3 结核病的实验室诊断 34 结核病的分子药敏
1.结核病的流行概况
全球范围内结核病疫情急剧恶化 • 人口大规模流动 • 结核菌耐药现象益发严重 • 结核病合并艾滋病感染 我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国 • 结核菌感染率44.5% • 新发活动性结核患者130万/年 • 死亡13万/年
当前结核研究的热点
• 新型抗结核药物(50%) • 新型快速诊断技术(40%) • 新型结核疫苗(10%)
近期结核病诊断方法的相关研究
JID 2012:205 (Suppl 2), S147.
7/45
2.结核病的病原学
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引 起人类结核病的主要病原体。
瓶外检测技术
瓶内检测技术 易导致污染及生物安全问题
15－21天
不详
无药敏试剂提供
只有3种一线药物
BACTEC™ MGIT™ 960/320
指示器系统
阴性培养
阳性培养
O2
O2
O2 CO2
O2 O2 O2
CO2 O2 CO2
O2 O2
FFFOOF22OFF2FOO22FFFOO22
上部空间
已预先充填10% CO2
1882年由德国医生Koch发现。 结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌
纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝 杆菌属。 分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、 非洲型和田鼠型，而人型结核分枝 杆菌是人类主要的致病菌。
10/8/2019
GDTB
8
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1. 细胞壁中含有大量 脂质 2.引起的疾病都呈慢性， 并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
528个瓶位
6~7个
9个
PH值比色法：当培养瓶内
有微生物生长，其释放出的 CO2，经水饱和后，产生H+， 使PH值产生变化，感应器的 颜色也随之变化。需双重反 应，因此速度较慢，假阳性
压力检测：检测细菌生长中各 种气体产生和消耗而引起的瓶 内压力的变化。灵敏度差。此 技术已趋向淘汰
率较高，此技术已趋向淘汰
荧光增强法：采用敏感性较 强的荧光信号探测氧气的变 化情况，只需单一反应，所 以速度快，准确性高
瓶外检测技术
8－11天 5种一线抗TB药物，全部具 有FDA及SFDA认证
普通细菌血培养系统 需加装分枝杆菌培养特殊组件
普通细菌血培养系统 需加装分枝杆菌培养特殊组件
240个瓶位 每年可检测2000个样本
WHO对结核抗体评估
WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明： 与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为 53~99% 1 。 原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不 同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。
WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一 步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。
γ-干扰素释放实验（IGRA）
γ 干扰素 检测阴性
γ干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
T-SPOT®.TB原理
T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10）， 通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存 在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核 杆菌（现症感染）的新方法。
• 基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意 大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核 诊疗指南中。
• 目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：
1）澳大利亚Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube （QFT-GIT）
2）英国Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB
生长特点：
生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内 约需要15～20小时，在静脉感染未经 免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬 细胞内约需要15～20小时，在家兔角 膜中约需要20～22小时。
实验室检查方法的历史
1880s
1900s 1920s
1930s 1940s 1950s
Tubercle bacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法 Mantoux test (TST with tuberculin) Petragnani medium Purified Protein Derivative（PPD） Lewenstein-Jensen 培养基 Dubos agar, Ogawa 培养基 Middlebrook 7H9
• 所有的卡介苗（BCG） 均丢失该基因序列
• 绝大多数的环境分枝杆 菌也不存在RD1区
结核杆菌特异抗原
非洲 牛
戈登 堪萨斯 海
苏氏
T-SPOT®.TB临床性能指标
• 特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆 菌和卡介苗（BCG）无交叉反应
美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
1WHO World Health Organization. Diagnosis evaluation series No.2: laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.
2011 WHO tuberculosis control report
我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一 2013年世界卫Байду номын сангаас组织宣布全球耐多药结核病紧急状态
全球的结核病患者,在接受治疗 之前已经传染给了别人！！！
早期快速诊断与治疗成为制 约结核病控制的关键：有细
菌学诊断依据的病人不超过50%
1990s 2000s 2010s 2020s
NAAT ELISPOT, QuantiFERON, LPA, GeneXpert ???
3.结核病的实验室诊断
细菌学
血清/免疫学
分子生物学
涂片： 敏感性低
传统固体培养： 所需时间长， 2~3月
液体培养及药 敏试验：平均 时间20天
血清学： 存在抗原 纯度和特 异性差等 方面的问 题
• 灵敏度 基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很 高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
灵敏度
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