微生物实验报告微生物的生理生化实验侯汶青201300140031 组别：周四下午五组同组者：李璇、李倩茜实验完成时间：2014年12月6号一、实验目的1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2、掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3、了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4、了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
5、熟习生理生化反应培养基的配制原理和一般方法步骤。
6、巩固无菌实验操作。
二、实验器材1、菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌（大分子水解实验）；大肠杆菌、变形杆菌（糖发酵实验）；大肠杆菌、产气杆菌（吲哚实验）；大肠杆菌、产气杆菌（甲基红实验）；2、培养基：（1）固体淀粉培养基，固体油脂培养基（淀粉和油脂的大分子水解实验）；（2）葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管每组共5支，而且内装有倒置的德汉氏小管（糖发酵实验）；（3）蛋白胨水培养基（吲哚实验）（4）葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红实验）3、溶液和试剂：卢戈氏碘液，乙醚，吲哚试剂，甲基红试剂，蒸馏水，去离子水、氢氧化钠溶液、中性红试剂、溴甲酚紫乙醇溶液等4、仪器或其他用具：成套培养皿，试管，玻璃棒、酒精灯，烧杯，德汉氏小管，接种环、吸管、滴管、洗耳球、无菌操作台、量筒、试管架等三、实验原理1、微生物的生理生化反应原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。
代谢过程主要是酶促反应过程。
许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。
在所有生活细胞中存在的这些化学反应被称为生理生化反应（酶促反应）。
2、大分子的水解实验：微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。
胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
在淀粉固体培养基上接种细菌，培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
3、糖发酵实验：糖发酵实验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。
例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。
当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。
气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
4、吲哚实验：IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methyl red test）、伏-普（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。
硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。
大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。
吲哚实验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。
但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
色氨酸水解反应：吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
5、甲基红实验：甲基红实验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。
尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。
这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
四、实验步骤（一）培养基的合成、灭菌及准备无菌操作台1、淀粉培养基(制备固体平板，每组2个平板):换算---称量---先将淀粉溶解再溶解其它成分---调pH值---装入500毫升三角瓶中---加棉塞---包扎---待灭菌。
2、油脂培养基（制备固体平板，每组2个平板）：换算---称量---油和琼脂及水先加热---调好pH后再加入中性红---装入500毫升三角瓶中---加棉塞---包扎---待灭菌。
3、葡萄糖发酵培养基(液体培养基，每组5支试管)：换算---称量---溶解---调pH值---加溴甲酚紫指示剂---分装小试管30支---加棉塞---包扎---待灭菌。
4、乳糖发酵培养基(液体培养基，每组5支试管)：换算---称量---溶解---调pH值---加溴甲酚紫指示剂---分装小试管30支并加入灌满培养基的德汉氏小管---加棉塞---包扎---待灭菌。
5、蛋白胨水培养基(液体培养基，每组5支试管):换算---称量---溶解---调pH值---分装大试管30支---加棉塞---包扎---待灭菌。
6、葡萄糖蛋白胨水培养基(液体培养基，每组5支试管):换算---称量---溶解---调pH值---分装大试管30支---加棉塞---包扎---待灭菌。
7、灭菌：将所有包扎好的含有培养基的试管和培养皿放入灭菌锅中进行灭菌。
8、准备无菌操作台：将无菌操作台的电源打开，通入无菌风并打开紫外灯进行灭菌准备工作，紫外灯约照射20min，并且关闭两侧的玻璃门。
20min后，关闭紫外灯，打开日关灯，放入酒精灯并点燃，准备进行实验操作。
（二）倒平板、接种、培养及观察分析A．大分子水解试验1．淀粉水解试验（1）固体淀粉培养基灭菌后取出，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板，冷却凝固并倒置。
（2）用记号笔在平板底部划成四部分。
（3）无菌操作台上，在酒精灯旁无菌操作用接种环将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别在平板的不同部分进行点种（如下图所示），尽量接种面积要小，而且注意在平板的反面的对应部分分别写上菌名进行标记，以防弄混。
（4）接种好后，将平板倒置，在37℃温箱中培养两天。
（5）两天后，观察平板上不同区的各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，然后观察菌苔颜色变化。
如若菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，细菌为阳性，否则细菌为阴性。
而且透明圈的大小可用来初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低（以“+”、“—”表示有无透明圈）。
2．油脂水解试验（1）固体油脂培养基灭菌后取出，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板，冷却凝固并倒置。
（2）用记号笔在在平板底部划成四部分，并且分别在四部分上标记菌种名称，以防弄混。
（3）无菌操作台上，在酒精灯旁无菌操作用接种环将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别划十字线（如下图所示）接种于平板相对应部分的中心，可以让接种面积大一些，但是不要太大。
（4（5）两天后，取出平板，加入中性红试剂，观察菌苔颜色。
如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。
B．糖发酵试验（葡萄糖和乳糖两种培养基）（1）液体培养基灭菌后取出，用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称或者在试管上粘贴记号标签标明发酵培养基名称，冷却。
（2）无菌操作台上，取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌1支试管、变形杆菌1支试管，第3支试管不接种，作为空白对照。
另取乳糖发酵培养基2支，同样分别接入大肠杆菌1支试管、变形杆菌1支试管，并且及时用记号笔或者标签在试管上做好标记，区分试管中接种的菌以及是否接种菌。
（3）将接过种和作为空白对照的10支试管均置37℃中培养两天。
（4）两天后取出试管，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
而且，培养后各发酵管与空白对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
C．吲哚试验（1）液体培养基灭菌后取出，冷却，无菌操作台上，将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基，并有一支试管什么都不接种，作为空白对照，5支试管均置于37℃恒温培养两天。
（2）在培养两天后取出试管，观察结果时，在培养液中加入乙醚约4-5滴（使呈明显的乙醚层）。
充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂2滴。
如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色（注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。
以“+”、“—”表示有无红色的玫瑰吲哚。
D．甲基红试验（1）液体培养基灭菌后取出，冷却，无菌操作台上，将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，并有一支试管什么都不接种，作为空白对照，5支试管均置于37℃恒温培养两天。
（2）培养两天后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
五、实验结果（一）大分子的水解实验（1）淀粉水解试验:（2）油脂水解试验:（1）葡萄糖发酵培养基：（2）乳糖发酵培养基:（1）吲哚试验:（2）甲基红试验:六、实验结果分析1、大分子的水解实验：微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。