（迈新）；或60℃过夜
染色前处理 －切片保存
切片不宜长时间在常温下保存
染色前处理 －脱腊
原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开
实验操作中的应用
抗原修复 实验操作中的注意事项
抗原修复
影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类
1）酶消化法 2）加热法（高压法›水煮法›微波法）
10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液， 光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗， 苏木素复染；
11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；
12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取 代第一抗体，其余步骤相同。
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片
具体步骤如下：
1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
复染
原则：注意两者之间对比，突出阳性信号
实验对照设计
原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照
编号 阳性片 待检片 阴性对照
结论
1
－
－
－ 操作失误，抗体失效
2
＋
＋
＋
非特异性着色
3
－
＋
－
阳性片不含靶抗原
4
＋
－
－ 待检片不含定位抗原
ห้องสมุดไป่ตู้
5
＋
＋
－
待检片含定位抗原
结果分析
1.特定的定位
胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥 散性。
CK10
免疫组化标准化照片
ER
CD44v6
2.染色的不均一性
阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在 分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量 的多少。
人肝癌中EGFR的表达
3.颗粒性显色
DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
人肺癌组织中P63的表达
7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育 过夜， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min；
9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵 育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min ；
免疫组织化学的应用
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
检测方法。如SP、LSABC、ABC等
显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测
显色系统
常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP) A:显色底物DAB-----棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-----砖红色 2.碱性磷酸酶(AP) 显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色
染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
染色前处理 －预防脱片
常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine）
注意：1）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度
染色前处理 －包埋与切片
包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时
抗原修复液的选择
1）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）
内源性过氧化物酶的灭活
存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞
消除方法：3% H2O2 浸泡10分钟
血清封闭
目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用
冲洗
一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗 增加效果 可加入Tween20
一抗孵育时间及抗体选择
应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37℃ 1-2 小时或 4℃ 冰箱过夜
检测及显色系统
一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的