酸奶中优势微生物的分离及乳酸菌饮料的制作滕小艳生命科学学院生物科学专业2006级1班指导老师：宋波摘要：为了解我们日常饮用的酸奶中益生菌的基本情况，本次实验通过酸奶的制作，菌种的活化，传代，分离鉴定和平板划线等方法，对其中的2种菌进行镜检和革兰氏染色以确定其类型，；然后用1种或2种等量混合的方法，发酵制成的产品，比较其发酵性能。

结论：在琼脂培养基上，圆形稍扁平的黄色菌落，及其周围培养基变为黄色者，即为乳酸菌。

乳酸菌根据细胞为球状或杆状，可分为两大类，即为乳酸链球菌和乳酸杆菌族。

嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的酸奶风味明显优于嗜酸乳杆菌单独发酵。

凝乳时间也大为缩短。

关键字：保加利亚乳杆菌嗜酸乳杆菌嗜热链球菌革兰氏染色混合发酵Yogurt microorganisms and lactobacillus drink productionTengXiaoYanLife science college of biological science class 1 grade 2006 ，instructor: song boAbstract: in order to understand our everyday drinkable probiotic yogurt, the basic condition of this experiment through, yogurt, strains of activation, separation and identification of flat nestin crossed, the method of the two kinds of bacteria for gram's staining and to determine the types. Then use one or two equal mixing method, fermented product, compares the performance of fermentation.Conclusion: in AGAR medium, circular slightly flat yellow, and its surrounding medium colony, to become yellow lactobacillus. According to the cells to aspen, globular or can be divided into two categories, namely, streptococcus and lactobacillus to lactic acid. Acidophilus andKey words：Bulgaria lactobacillus acidophilus streptococcus thermophilus cultured mixed fermentation gram's staining.嗜酸乳杆菌存在于人类和一些动物的小肠内，它在代谢过程中产生能产生乳酸﹑过氧化氢﹑乳酸杀菌素和类细菌素，从而抑制肠道内有害菌的生长，调整胃肠环境，同时嗜酸乳杆菌还有防治结肠癌和降低体内胆固醇的作用。

由于嗜酸乳杆菌优良的保健功能及耐酸和耐胆汁的特点，因而被称为第三代乳酸发酵剂，发展前景十分广阔，但嗜酸乳杆菌的生产特性差，凝乳时间长，风味口感不好，本研究利用球菌和杆菌之间相互促进的共生作用，将嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合培养，以求得最佳的生产效果，从实验结果可以看出：两种菌混合的产酸能力要高于单独培养。

影响凝乳时间各个因素的主次顺序为：其中接种量对对凝乳时间的影响要远远大于其它三个因素。

影响产品感官评定指标各个因素的主次顺序为：其中加糖量对感官评定指标的影响最大，其次为接种量和培养温度，菌种配比的影响最小。

综合考虑各因素对凝乳时间和感官评定的影响后得出和混合发酵生产酸奶的最佳工艺参数：接种量，加糖量，培养温度。

1．材料和方法1.1材料1.1.1培养基BCG牛乳培养基：A溶液—脱脂乳粉100g，水500ml,加入溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液1ml,80℃灭菌20min,B溶液—酵母膏10g，水500ml,琼脂20g,PH6.8,121℃湿热灭菌20min,以无菌操作趁热将A﹑B溶液混合后倒平板。

细菌培养基—1.成分：牛肉膏0.5g,蛋白胨1.0g,NACL0.5g,蒸馏水100ml,PH7.2~7.5。

2.制法：加热溶解，调PH值，分装于三角瓶中121℃,20min高压灭菌。

脱脂乳试管—直接选用脱脂乳液或脱脂乳粉与5%蔗糖水为1：10的比例配制，装量以试管的1|3为宜，115℃灭菌15min。

1.1.2原料，脱脂乳粉，全脂灭菌的纯牛奶1L，蔗糖。

1.1.3仪器及用具：恒温水浴锅，酸度计，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养箱，酸乳瓶（200~300ml），灭菌的平板培养皿，300ml三角瓶，试管，移液管。

1.2方法1.2.1制备平板培养基配BCG溶液，0.8gBCG加入50ml 20%乙醇中，其中20%乙醇由25ml 95%的酒精+75ml 蒸馏水制成，然后配A溶液﹑B溶液，分开灭菌，各500ml,在无菌操作台上趁热将A溶液﹑B溶液混合均匀后，倒平板30个。

1.2.2制备稀释液（无菌操作）将混合菌种在无菌操作台上倒入1L的全脂灭菌的纯牛奶中，盖好盖子，在37℃恒温培养箱中培养6~8h,再取出，用手摇动，感觉是否变稠状。

然后用灭菌的移液管取0.5ml放入4.5ml无菌水的试管中，依次稀释到10-5，取10-4﹑10-5两个稀释度的稀释液各0.1~0.2ml，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上各5个平板，用无菌涂布器依次涂布;或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40℃培养48h,将接种好的培养皿倒置，即平皿盖朝下放置。

用于进一步纯化分离或直接转接斜面，1.2.2 平板划线分离微生物1.2.2.1 倒平板按无菌操作要求，在酒精灯火焰旁边操作，取融化并冷却至不烫手的培养基，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。

1.2.2.2 划线分离使用接种环，分别从10-4﹑10-5两个稀释度所倒的平板培养基中挑取不同的单菌落，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，依次编号为A1-A5，然后将接种好的培养基倒置，于40℃中恒温培养48h。

[1]1.2.3微生物的复筛培养3天后再按照平板划线的方法从A1-A5培养基中挑取单菌落接种到相应的平板培养基，依次编号为B1-B5，然后将接种好的培养基倒置，于40℃中恒温培养48h。

1.2.4微生物的镜检及鉴定1.2.4.1 观察菌落的基本形态从各培养基中选取不同的单菌落，观察其形状及颜色，并记录。

1.2.4.2 观察该菌株的活菌（常用压滴法）首先将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。

将酒精灯放于自己的正前方，点燃。

然后用无菌操作方法挑取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀,把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。

接着用镊子取一洁净的载玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。

如菌液过多，可用吸水纸吸去一部分。

先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。

[2]1.2.4.3菌种的鉴定选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝乳的牛乳管，作菌种待用。

1.2.5 .乳酸菌的饮料的制作1.2.5.1将脱脂乳和水以1：7~10（W/V）的比例，同时加入5%~6%蔗糖，充分混合，于80~85℃灭菌10~15min，然后冷却至35~40℃，作为制作饮料的培养基质。

将纯种嗜热链球菌﹑嗜酸乳杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂[3]，均以2%~5%的接种量分别接入以上培养基基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。

接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3~5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。

1.2.5.2把接种后的酸乳瓶置于40~42℃恒温培养箱中培养3~4h。

培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。

然后转入4~5℃的低温下冷藏24h以上。

经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(PH4.0~4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

1.2.5.3以品尝为标准评定酸乳质量采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株酸乳发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。

品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。

比较项目见表—2。

1.2.6微生物的生理生化性质的测定1.2.6.1革兰氏染色首先制片、涂菌，用无菌操作方法分别从试管中沾取菌种一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀，直径约1cm的菌膜，涂菌后接种环火焰灭菌。

干燥于空气中自然干燥.亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。

固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于颜料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰三次，以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形，此制片可用于染色。

初染于制片上滴加结晶紫染液染，1分钟后，用水洗去剩余染料。

媒染滴加卢戈氏碘液，1分钟后水洗。

脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止（根据涂片之厚薄需时30秒至1分钟），水洗。

复染滴加石炭酸复红液复染1分钟，水洗。

用滤纸吸干，油镜镜检。

最后观察并记录结果1.2.7发酵性能的测定[4]将分离得到的4株菌以5%的比例接种于无菌脱脂乳培养基中，37℃恒温培养箱中发酵8h，冷却并在冰箱中冷藏（4℃）10h后定各指标。

滴定酸度的测定：取待测酸乳样品，用浓度为10g|L的氢氧化钠溶液测定滴定酸度；PH值的测定：取待测酸乳样品，用ZD-2型自动电位测定仪测定PH值；黏度的测定：取酸乳样品中用NDJ-8S型数显黏度计测定黏度；保水率的测定：在离心管中各放入质量W为10g的酸乳，于3000r|min离心10min。

2.结果与分析2.1酸奶中微生物的的稀释分离恒温箱培养后1-5号培养基上面都有菌落长成，根据菌落形态初步判断有乳酸菌。

2.2平板划线分离微生物划线分离后恒温培养结果：各培养基上均有单菌落生成。

2.3微生物的复筛各培养基上长出的菌落形态颜色较为均一，可以作为下一步实验的对象，其他培养基上的菌落差异较大。

2.4微生物的镜检及鉴定（1）保加利亚杆菌细胞形态长杆状，两端钝圆。

固体培养基生长的菌落呈棉花状。

易于其他乳酸菌区别。

能利用葡萄糖﹑果糖﹑乳糖进行同型乳酸发酵产生D型乳酸（又酸涩味，适口性差），不能利用蔗糖[3]。