中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
细菌内毒素检查标准起草
（二）预试验 供试液配制成一系列浓度：可采用对倍稀释法。 原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍稀释液 鲎试剂（TAL） 灵敏度为λ 细菌内毒素工作标准品液配制：2λ浓度 加样试验 编号 原液 2倍 4倍 8倍 16倍 32倍 64倍 128倍
静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质 （非降压药）。 可考查建立细菌内毒素检查法。
肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
热原标准起草
• 剂量设定：临床成人1小时内最大用量的3～5倍。
考虑几点: 毒性、干扰、药物本身具有解热性问题。
• 供试液浓度确定：考虑两点: 溶血、刺激性。
无降压作用的药品： 临床单次用量的1/5~5倍； 有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4~ 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。
建议：按临床用量来设定，考虑毒性问题。
供试液浓度确定：溶血、刺激性。 给药体积确定： 标准文字表述：
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
使用超过10次者
• 不同点：体重无上限
• 使用次数不再规定10次
• 建议：
附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔预选 • 未曾使用过的家兔。 • 供试品合格，但升温≥ 0.6℃，休息达2周以上。 • 3周内未曾使用的家兔。
•
预选条件应与正式实验一致。
•
休温应在38.0 ～ 39.6℃。
•
每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4℃
• 供试品不合格的家兔淘汰
• 建议：关于升温的家兔 关于降温的家兔
附录ⅩⅢE 异常毒性检查法
异常毒性检查 • 初试动物要求：17~20g，5只。 • 复试动物要求：18~19g，10只。 • 给药时间：各论下有规定者按各论项下规定时间，
否则按每只4～5秒。 • 结果观察：给药后观察48小时。 • 结果判断：以动物是否死亡作为判定指标。
• 供试液配制 • 试验剂量 • 结果观察 • 结果判断
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
细菌内毒素检查标准起草
举例：某中药注射液
[用法与用量]静脉滴注：一日20～40ml，以10%葡萄糖注射液200ml
或氯化钠注射液100ml稀释后使用。
（一）内毒素限值确定：L=K/M
5EU/（kg.h) = ———————— = 7.5EU/ml
• 数值修约：四舍六入五成双 12.1498≈12.1; 12.16 ≈12.2 12.150001 ≈12.2; 12.15 ≈12.2; 12.45 ≈12.4
• 得出结论
附录ⅩⅢ A 热原检查法
结果判断（2019版）
• 初试合格 • 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.4℃ • 需复试 • 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或均不超
≥1.3℃ • 初试不合格 • 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只 • 复试合格 • 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8
只总和≤3.5 ℃ • 复试不合格 • 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只
总和＞ 3.5 ℃
附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔的重复使用 • 供试品合格的家兔 至少休息48小时。 • 升温≥ 0.6 ℃的家兔，至少休息2周以上，且通过预选合格。
其他一些微生物、类固醇等。 • 存在：无所不在，水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。 • 性质：细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份，主要为脂多糖，致
热性极强，具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂，不易破坏，同时具有水溶 性、不挥发性、滤过性，在药品生产过程中不易去除。 • 不良反应：引起人体发冷、寒颤，然后引起发热，甚至昏迷和休克。
试管编号 2%兔红细胞混悬液ml 0.9%氯化钠溶液ml 蒸馏水ml 供试品溶液ml
1样品 2.5 2.2
0.3
2样品 2.5 2.2
3颜色 4.7ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0.3
0.3
• 温育: 37±0.5 ℃, 3小时。
• 结果判断
• 几个问题 试验剂量问题，结果判断问题
•
乳状液型注射液实验观察问题
4阴性 2.5 2.5
• 注射体积确定：
• 标准文字表述：
异常毒性标准起草
• 剂量设定：应低于最低致死量，1/3LD1或者1/4LD50。 • 建议：最好低于明显出现药物本身毒性的剂量。
•
根据临床用药量来确定。
• 标准文字表述：
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
降压物质检查标准起草 • 本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。 • 剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。
过敏反应标准起草
• 豚鼠毒性试验 • 剂量设定：在考虑毒性的基础上，剂量应尽可能大，
同时考虑临床用量。
致敏次数及激发时间：应当作研究，而不是完全按试验 方法规定次数与时间来操作。
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
溶血与凝聚标准起草 • 实验方法问题：取样量、供试液。 • 结果判断问题：振摇引起的争议。 • 个人提出的修改方法 建议以此作为内控标准。
5阳性 2.5
2.5
附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素（Endotoxin） 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性， 其化学结构是脂多糖（LPS）。
• 生物活性 致热性 、与鲎试剂反应 • 特点
广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子 致热活性的高度不均一性 • 细菌内毒素标准品 参考标准品（国际 国家标准品） 国家工作 标准品 • 企业工作品
过0.6 ℃，但总和≥1.4℃ • 初试不合格 • 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只。 • 复试合格 • 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8
只总和≤3.5 ℃ • 复试不合格 • 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只
总和＞ 3.5 ℃
结果判断（2019版）
• 初试合格 • 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.3℃ • 需复试 • 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或总和
成方制剂和单味制剂
• 止喘灵注射液 异常毒性 • 注射用双黄连（冻干） 溶血与凝聚、热原 • 清开灵注射液 异常毒性、热原、溶血与凝聚 • 注射用灯盏花素* 热原、过敏试验、降压物质、异常毒
性、溶血与凝聚
附录ⅩⅢ A 热原检查法
• 热原（Pyrogen ） ：系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。 • 来源：临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌，以及
40ml/60kg.h
需要考虑的因素：5EU/（kg.h)只是理论数值，以此给家兔，有一半体温上升； 临床联合用药；注射器、输液器含内毒素，人体内含有的内毒素。
最后可以确定内毒素限值为 L=4EU/ml。
*体表面积给药的计算：中国人体表面积按1.62m2计算。 比如：某药临床人用量为100mg/m2 则 100mg/m 2×1.62m2=162mg 162mg/60kg=2.7mg/kg
附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成
规格: 0.1ml; 0.5ml. 灵敏度（λ）
对鲎试剂灵敏度的正确理解。 • 鲎试剂的灵敏度复核
细菌内毒素工作标准液的配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ 鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断
附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 附录ⅩⅧ B 中药注射剂安全性检查法指导原则 • 附录ⅩⅧ C 中药生物活性测定指导原则
凡例--动物试验
2019年版一部
2019年版一部
• 动物品系、年龄、性别应 符合规定。
• 尽量取代动物试验，减少 动物使用量。
• 动物应健康。
• 动物品系、年龄、性别、 体重应符合规定。
凡例--动物试验
实验动物的要求 • 应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。 • 动物应品系、年龄明确。 • 动物性别、体重应符合试验需要。 • 应有严格检疫制度。 • 使用前应正常饲养至适应使用环境。 • 应有动物处理制度。
• 灵敏度复核结果
• 实验成立与否的判断
内毒素浓度（EU/ml)
2λ
λ
反1
+
+
应2
+
+
管3
+
+
号4
+
+
• 结果计算方法:λc=anitlg(∑X/4)
•
X为反应终点的对数（lg)值。
• 不需要计算的几种情况
1/2λ -
1/4λ -
附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素的常规检查
例1：取本品，用细菌内毒素检查用水至少稀释20倍后，依法检查，本 品每1ml中含有的内毒素应小于1. 25EU。
2019年版药典一部
生物安全性检查和生物活性测定法介绍
张德波 成都市食品药品检测心(成都市药检所)
2019年版药典一部安全性检查内容介绍
• 凡例 动物试验(四十五) • 成方制剂和单味制剂 四个品种 • 附录ⅩⅢ
• ⅩⅢ A 热原检查法 • ⅩⅢ D细菌内毒素检查法 • ⅩⅢ E异常毒性检查法* • ⅩⅢ G过敏试验检查法* • ⅩⅢ H 溶血与凝聚试验*
癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳 或倒地、抽搐、休克，死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。
• 保证实验可靠的几点建议： 设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题
对该试验的几点思考：实验剂量、实验动物数、观察指标。
附录ⅩⅢH 溶血与凝聚检查法
• 2%兔红细胞混悬液配制 • 操作法
附录ⅩⅢ A 热原检查法
2019年版药典