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2.7.2预培养（增菌培养）：
• 取供试液10mL（相当于1g样品），加在 定）中，30〜35℃培养24〜48小时。 ml增菌液体培养基（经方法适用性试验确
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耐胆盐革兰阴性菌 肠道菌增菌液体培养基
大肠埃希氏菌 沙门菌 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪大豆胨液体培养基
2.7.3选择和分离培养
（3）物品取出,
• 随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者,不可作为无菌物 品使用。培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。 取出的物品掉落在地或误放不洁处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使 用。取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。凡属 合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
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有毒有菌污物处理要求
• 1.4.5污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒 袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
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1.5培养基制备要求
1.5.1根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶 于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。 1.5.2因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太 多，以免影响培养基的质量。
1.3.2装放
• （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
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（2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不 能过挤。
1.3.3设备检查
• • • （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。 （2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察 是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。 （3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于 进行灭菌处理的要求。
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选择和分离培养
• 2.7.3.3沙门菌：0.1 ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，30〜35℃培养18〜2 4 小时。
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2.7.4平板划线分离培养
（1）培养基平板的准备：取培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中， 每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。 耐胆盐革兰阴性菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 大肠埃希氏菌 沙门菌 麦康凯琼脂培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
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1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平 皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
1.1无菌操作要求
• 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中 取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
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1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与 杆的连接处。
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3.2.3沙门菌：
• 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的 斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定 试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为 阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见 黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。
有毒有菌污物处理要求
• 1.5.3盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器（三角烧瓶）为 好。
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1.5.4每批培养基制备好后，应做无菌生长试验（空白平皿试验）及所检菌株生长试验。 如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培 养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
• 右手握一次性接种针，把接种针上的菌液涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将环上 的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线， 如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线 重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。
2015年版药典
• 微生物检验规程
1.1无菌操作要求
• • 1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
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1.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
1.1无菌操作要求
• 1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的 器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
1.3消毒灭菌要求 1.3.1灭菌前准备
• 1.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过 小窗传递。
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（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应 将上面通气孔打开。
（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装 300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。
（2）各种物品的准备
• 取出预培养后的控制菌供试液，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、一次性接种针、 火柴、酒精棉球、试管架等。可在阳性菌室或无菌室操作，无菌室准备工作相同。
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（3）平板划线
以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成 30°角，以便划线。
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• • 2.7.4培养：接种后的平板倒置叠放置于培养箱中，30〜35℃培养18〜24小时。 2.8培养物的观察
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2.8.1需氧菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。
2.8.2霉菌和酵母菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。 2.8.3大肠埃希菌：每天观察菌落的生长情况。 2.8.4沙门氏菌：菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。如有疑似菌 落则用接种针挑选于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18 〜2 4小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。
有毒有菌污物处理要求
• 1.4.3涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，强致病菌的冲洗液必须冲在烧 杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后， 煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。 1.4.4打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡 半小时后再擦拭干净。
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• 2.6.2平皿的制备：3个稀释级（常用10-1、10-2、10-3）（每稀释级每种培养基至少 制备2 个平板），同时做空白（等量稀释剂）〖供试液用量为适应性试验确定的，常 用1ml〗 2.6.3加入培养基：取培养基，融化并让其冷却至45℃左右，倾入已加入供试液的平皿 中，每个平皿约15mL（即倾倒时液面刚刚闭合时），在超净台面上轻轻晃动使供试 液均匀混合于培养基中，放置一旁待冷却凝固。
1.3.4灭菌处理
• (1) 干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。灭菌完毕后或温度升 温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。
• (2)立式压力蒸气灭菌器：待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体 物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降 到60℃以下 再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
2.6微生物计数检验（平皿倾注法）
• • 2.6.1供试液制备 2.6.1.1称取样品：一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2; 贵重药品、微量 包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大 蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片。 2.6.1.2稀释液制备：0. 9%无菌氯化钠溶液
• 2.7.3.1耐胆盐革兰阴性菌：取相当于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和 0.001tnl) 供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法适用性试验确定） 肠道菌增菌液体培养基中，30〜3 5℃培养24〜4 8小时。 2.7.3.2大肠埃希氏菌：l ml接种至100 ml麦康凯液体培养基中，42〜44℃培养24〜4 8 小时。
3.数据报告
• 3.1平皿法：点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不 宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌 数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。
3.2控制菌
• 3.2.1耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养 管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表2查l g 或lm l供试品中含有耐胆 盐革兰阴性菌的可能菌数。 3.2.2大肠埃希菌：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜 的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或 虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
1.4有毒有菌污物处理要求
• 1.4.1经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地 点，待统一进行高压灭菌（经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌）。
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1.4.2染菌后的吸管（即进行阳性菌操作后的），使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸 液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。