福建农林大学学报(自然科学版)第39卷第5期Journa l of Fujian A griculture and Forestry U n i versity(N a t ura l Sc i ence Ed iti on)2010年9月锥栗果实双向电泳体系的建立郑诚乐,钟凤林,潘东明,刘小芝(福建农林大学园艺学院,福建福州350002)摘要:通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同p H值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于p H4-7.关键词:锥栗;蛋白质组;双向电泳中图分类号:S664.2;Q946.33文献标识码:A文章编号:1671-5470(2010)05-0475-05Establis h m ent of t wo-di m ensional electrophoresis syste m for chinquapin fruitsZ HENG Cheng-le,Z HONG Feng-li n g,PAN Dong-m ing,LI U X iao-zh i(Co lleg e o fH o rti culture,Fu ji an A g ricu lt ure and F orestry U niversity,Fuzhou,F uji an350002,Ch i na)Abstrac t:T he conven tiona l t w o-di m ensi onal electropho res i s techno l ogy w as i m proved i n o rder to deve l op an appropriate approach for proteo m ics of ch i nquapin fruits.T he study w as done by opti m izi ng different prote i n extraction me t hods and co m pa ri ng IPG str i ps at d ifferen t p H values.W it h the i m proved pro tein extraction m ethod,a stab l e,reproduc i b l e and h i gh reso l u tion2-D e l ectrophoresis m ap w as obta i ned.A fter sil ver staini ng,m ore than400prote i n spo ts w ere detected,w ith t he ir isoe l ec tric po i nts(pI)m a i nly at p H 4-7.K ey word s:chinquapi n(Castanea henry i R ehd.&W il s.);pro teom e;t w o-di m ensi onal e l ec trophoresis双向电泳(t w o-d i m ensional e lectropho resis,2-DE)是蛋白质组学研究中的核心技术之一,是目前常用的能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法,广泛应用于生物学研究的各个方面.双向电泳技术利用蛋白质的等电点和相对分子质量差别将各种蛋白质区分开来,其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点,使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段.对蛋白进行分离、鉴定,分析特异蛋白的功能及其作用机制已成为当今研究热点[1-3].锥栗(Castanea henry i Rehd.&W ils.)是我国南方栽培驯化最早、利用最久的经济林树种之一,也是我国古老的名特优稀落叶果树[4,5].锥栗果实外形光洁美观、果肉细嫩香甜,含有淀粉、糖、蛋白质等主要营养成分及18种钙、锌、磷、钾、铁等矿物质[6].目前对锥栗果实营养品质的研究主要集中在成分分析方面[4-9],有关其营养品质的变异和相关性的研究尚未见报道.应用双向电泳对锥栗蛋白质组分进行质谱分析在国内外都少见报道.因此,本试验通过建立适于处暑红锥栗果实蛋白质分离的双向电泳体系,对蛋白质样品的制备、电泳参数和固相p H梯度干胶条等进行优化,以期提高锥栗果实蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,得到适于其分析的双向电泳试验条件.1材料与方法1.1试剂与仪器丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、I PG胶条(pH3-10,13、18c m;p H4-7,13、18c m)、I PG buffer(p H3-10;p H4-7)、胶条覆盖液(矿物油)、Phar m y lte、碘乙酰胺、C HAPS、二硫苏糖醇(DTT)和TE M ED均购自Am ersha m Phar m acia公司;苯甲基磺酰氟(P M SF)购自Sig m a公司;其他试剂为国产分析纯.收稿日期:2009-09-22修回日期:2010-03-10基金项目:国家支撑计划项目(2007BAD07B01);福建省科技厅资助项目(K02058).作者简介:郑诚乐(1963-),男,副教授,博士.研究方向:果树栽培.Ema i:l zcl2003@126.co m.通讯作者潘东明(1956-),男,教授,博士生导师.研究方向:果树栽培生理及生物技术.Em ai:l pdm6666@126.co m.IPGphor Ó,E ttan DALT si x ,M ulti T e m p Ó,EPS 601,I m age scanner Ò扫描系统,双向电泳分析软件I M P 6.0均为美国通用公司产品.1.2 蛋白质样品的提取2007年8月8日从建瓯采集正常发育与败育趋势的处暑红锥栗幼果果实,用液氮速冻,保存在-40e 下备用.1.2.1 TCA-丙酮沉淀法的提取 称取2g 果实样品,加入液氮研磨成细粉,装入离心管中,加入8mL 冷丙酮Ñ(含体积分数为10%的TC A 、0.7g #L -1B -巯基乙醇),涡旋混匀后于-20e 下静置2-4h ,在20000g 下离心15m in ,弃上清液;取沉淀物,加入8mL 冷丙酮Ò(含体积分数为0.07%的B -巯基乙醇),涡旋混匀后于-20e 下静置30m i n ,在20000g 下离心15m in ,弃上清液;重复上一步;沉淀中残留的丙酮挥发干净后,于-20e 保存[4].称取20m g 丙酮干粉,加I EF ,用400L L 上样缓冲液溶解.缓冲液含480g#L -1尿素、50g #L -1两性电解质(p H 3-10)、20g #L -1NP -40、50g #L -1B -巯基乙醇.涡旋混匀后于37e 下水浴2h ,在15000g 下离心20m in ;取上清液加入4倍体积的冷丙酮,室温沉淀1h ,在15000g 下离心20m in ,弃上清液;沉淀加I EF ,用50L L 上样缓冲液溶解,于37e 下水浴30m in ,在15000g 下离心5m in ,取上清液分装冻存.1.2.2 裂解液提取 称取1g 样品,加入液氮研磨成细粉,装入离心管中,加I EF ,用3mL 裂解液(与1.2.1的上样缓冲液成分一致)溶解.涡旋混匀后于37e 下水浴2h ,在15000g 下离心20m i n ;取上清液加入4倍体积的冷丙酮,室温沉淀1h ,在15000g 下离心20m i n ,弃上清液;取沉淀物,加入8mL 冷丙酮Ò(含体积分数为0.07%的B -巯基乙醇),涡旋混匀后于-20e 下静置30m i n ,在20000g 下离心15m i n ,弃上清液;重复上一步骤2次;沉淀中残留的丙酮挥发干净后,加I E F ,用50L L 上样缓冲液溶解,于37e 下水浴30m in ,在15000g 下离心5m i n ,取上清液分装冻存.1.3 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定采用Bradford 法[10].Bradford 储存液由100mL 95%乙醇、200mL 88%磷酸、350mg考马斯亮蓝G-250组成.工作液由425m L 双蒸水、15mL 95%乙醇、30mL 88%磷酸、30mL B radford 储存液组成,经滤纸过滤,用棕色瓶保存于室温下.用BSA 做标准曲线.将BSA 用双蒸水配制为1m g #mL -1的标准溶液,吸取一定体积的标准溶液和样品液放入5mL 的Eppendorf 管中,最大体积为80L L ,不足80L L 的添加双蒸水至终体积为80L L,再加入4m L B radford 工作液混合均匀,在2m i n 内测D 595n m ,测量在1h 内完成.利用不同BSA 的光密度值作标准曲线,计算得到样品中蛋白质的含量.1.4 锥栗蛋白质组的双向电泳1.4.1 双向电泳 剥开I PG 胶条保护膜后,将I PG 胶条胶面朝下置于预先加好样品液的聚焦槽凹槽中,矿物油覆盖后,室温水化16-18h(水化上样240L g),然后进行等电聚焦(I EF)电泳.参照Am ersha m 公司双向电泳手册,I EF 采用I PGpho r Ó-第一向等电聚焦仪(Am ersha m Phar m acia)进行,选用13c m 胶条(pH 3-10),蛋白400L g 泡涨上样.I EF 参数设置:300V 12h,500V 1h ,1000V 1h ,5000V 2h ,8000V 持续至总伏小时达65000h .将聚胶好的胶条分别在含有1%DTT 和2.5%碘乙酰胺的平衡液(6mo l #L -1尿素,75mm ol #L -1Tris -H C ,l p H 8.8,29.3%甘油,2%SDS,0.002%溴酚蓝)中平衡20m i n .1.4.2 银染 Bu l m 银染采用40%甲醇、10%乙酸固定胶1h ,30%甲醇洗胶2次,每次20m i n .水洗20m in .0.02%硫代硫酸钠增敏1m in .水洗3次,每次20s .冷的0.2%Ag NO 3、0.02%冷甲醛在4e 染色20m in .水洗,每次20s .更换盛胶的容器.水洗1m i n .0.05%甲醛,3%Na 2CO 3显色.观察颜色的变化,在显色液变黄时更换显色液,当染色完全时,5%乙酸终止显色.水洗3次,每次10s .1%乙酸4e 保存.1.4.3 凝胶图像分析 分析软件是I m age M aster T M 2D P lati n u m soft w are ,用I m age scanner Ò扫描系统成像,激发光为532nm 激光,扫描分辨率为10@10-6m.利用I M P 6对凝胶图谱进行背景扣除、标准化、点探测及匹配.#476#福建农林大学学报(自然科学版)第39卷2结果与分析2.12种蛋白质提取方法的比较2种蛋白质提取方法的比较表明,TC A-丙酮沉淀法获得了较大的提取物,但定量分析发现之中仍然有大量的杂质,双向电泳结果较差,效果不理想(图1).这是由于TCA-丙酮沉淀法直接将干物质沉淀下来,蛋白质与膜或者其他组分的结合并没有很好地分离,而锥栗果实中纤维素和多糖等非蛋白质成分含量特别高,需要大量的裂解液才能从干粉中重新溶解蛋白质,因此,获得的蛋白质溶液浓度低,双向电泳检测不到蛋白质点,而浓缩蛋白质不仅费事,而且会损失部分蛋白质.而利用裂解液提取蛋白质,能够把蛋白质与纤维素、多糖等成分很好地分离,大量的沉淀物丢弃后,得到的蛋白质粗提物含量高,经过沉淀、溶解后得到蛋白质浓度高(图2),双向电泳结果表明其分离的蛋白质点多,蛋白质点清晰,杂质含量少,效果理想,适合锥栗果实的蛋白质提取.图1TCA-丙酮沉淀法提取的总蛋白电泳结果图Fi g.1The p rot ein s a m p l es extracted w ith acetone图2p H3-10蛋白质双向电泳扫描图谱Fi g.2I m ages of p rot ein s pots for2-DE fro m p H3-10I PG s trips图3软件分析pH3-10蛋白质图谱Fi g.3I m age analys i s of c h i n quapin p rotei n2.2不同p H值IPG胶条的比较为获得正常发育与败育趋势处暑红幼果果实蛋白质差异表达的信息,分别将蛋白质样品在p H3-10、p H 4-7的I PG胶条进行2-DE.在相同电泳参数条件下,蛋白质样品在p H3-10的双向电泳分离得到蛋白质点为400?20(图2、3);在p H4-7的双向电泳分离得到蛋白质点为350?50(图4、5),p H4-7的I PG胶条分离得到的蛋白质分布更加均匀,能够形成更宽、更清楚的pH范围.因此,p H4-7的I PG胶条比p H3-10的得到的蛋白质信息量更大,更适合于锥栗幼果果实功能蛋白质的分离.以上说明,p H范围宽的I PG胶条适合于植物材料的初步筛选,而p H范围窄的I PG胶条适合于植物材料功能蛋白质的分离.2.3正常果实与败育趋势果实的比较通过p H4-7的线性I PG胶条对锥栗正常发育与败育趋势幼果果实的蛋白质进行2-DE比较分析,应用I m ageM aster TM2D Plati n um软件对蛋白质胶进行多项分析检测,均可以获得高敏感、高分辨的图像(图4、5).软件分析每块胶得到蛋白质点为350?50.以锥栗正常# 477 #第5期郑诚乐等:锥栗果实双向电泳体系的建立发育幼果果实的蛋白质胶作为参照胶,发现丰度变化在2倍以上、重复性好的差异表达蛋白质60个.说明本方法适合于锥栗幼果果实差异蛋白质组学的分析.3 讨论自1975年O c Farrell 建立蛋白质双向电泳系统以来,经过不断改进和发展,现已成为大量、快速、高分辨率地分离蛋白质的方法,是蛋白质组学研究最常用、最有效的手段之一,可清楚、直观地呈现每个蛋白质的等电点和相对分子质量以及表达量,是其他分离方法所无法比拟的[10].样品制备和溶解处理的好坏直接影响双向电泳的效果,是双向电泳最为关键的一步.选择适宜的提取方法是成功的前提[11].锥栗果实的多糖及淀粉等物质对I EF 干扰大,而TCA-丙酮沉淀法对其多糖、酚类物质的去除效果有限,导致蛋白的丢失,因此,本试验采用缓冲液直接提取方法,简单快速,蛋白质点清晰可见,蛋白分离效果佳.IPG -DALT 系统操作简便,分辨率高,重复性好.不同p H 范围的I PG 胶条得到的蛋白点数不同,要根据情况加以选择[12].本研究表明,p H 4-7的I PG 胶条比p H 3-10的I PG 胶条得到的蛋白质信息量更大.p H 范围宽的IPG 胶条能反应锥栗胚胎蛋白质的特征,但难以有效区分等电点接近的蛋白.在p H 4-7分离出大量的蛋白质,说明锥栗胚胎的功能性蛋白质主要分布在该区域.#478#福建农林大学学报(自然科学版)第39卷图像分析和数据处理是蛋白质组学研究的重要内容,可以将每个蛋白质的等电点、分子质量、表达量等信息进行数字化,输入数据库,同时也是比较蛋白质组学进行差异表达分析的基础和前提[13].采用I m -age M aster T M 2D Platinum 软件对蛋白质胶进行多项分析处理,可获得高敏感、高分辨的图像,并保证结果的可靠性,适用于分离植物胚胎的蛋白质.本研究对正常发育与败育趋势锥栗幼果果实的蛋白质胶进行多项分析处理,获得了丰度变化在2倍以上、重复性好的差异表达蛋白质60个.参考文献[1]DAV ID K,J OS HUA B,DOUG LA S W S ,et a.l T he comp l em ent o f pro tei n phosphatase cata l y ti c subun its encoded i n t he ge -no m e of A rabidop sis [J].P lant Physi o ,l 2002,129:908-925.[2]M UM BY M C ,W ALTER G.P ro tein seri ne /threonine phosphatases :structure ,regu l a tion ,and function[J].Physi o log ica lR e -v ie w,1993,73:673-699.[3]O c FARRELL P H.H i gh reso luti on t wo -d i m ensi onal e l ec trophoresis of pro te i ns[J].Journal of B io l og ica l Chem istry ,1975,250(10):4007-4021.[4]S ARAVANAN R S ,ROSE J K.A cr i tical evalua tion of samp l e ex tracti on techniques for enhanced pro teo m ic ana l y si s o f reca lc-itrant p l ant tiss ues[J].P roteom ics ,2004(4):2522-2532.[5]吴连海,龚榜初,赖俊声,等.浙南闽北锥栗品种资源调查研究[J].浙江林业科技,2007,27(1):33-37.[6]龚榜初,谢碧霞,吴连海,等.锥栗种内表型性状变异的研究[J].江西农业大学学报,2006,28(5):706-712.[7]景芸,梁一池,杨华.不同锥栗无性系果实营养成分的比较分析[J].浙江林学院学报,2004,21(2):176-179.[8]宋爱云,陈钦.锥栗栽培品种果实营养成分差异的分析[J].经济林研究,2001,19(4):5-7.[9]郑诚乐,吴少华,佘文琴,等.锥栗果实营养成分分析与品质的模糊评判[J].福建林学院学报,2003,23(4):293-296.[10]CAND I ANO G,BRU SCH IM,MU SANTE L,e t a.l Blue s il ve r :A ve ry sensiti ve co llo i dal Coo m assi e G-250sta i n i ng for pro -teome analysis[J].E lectropho res i s ,2004,25:1327-1333.[11]夏其昌,曾嵘.蛋白质化学与蛋白质组学[M ].北京:科学出版社,2004:244.[12]钱小红,贺福初.蛋白质组学:理论与方法[M ].北京:科学出版社,2003:48-63.[13]文李,刘盖,王坤,等.水稻花药总蛋白质双向电泳方法的改良与优化[J].分子细胞生物学报,2006,39(5):473-476.(责任编辑:陈幼玉) #479# 第5期郑诚乐等:锥栗果实双向电泳体系的建立。