– 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； – 2）PH中性或易调为中性； – 3）浓度大时渗透压不大； – 4）对细胞无毒。
二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖 与脂类等的显示方法
原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特 殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中 的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的 分布和含量。
4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质。
Schiff反应 联苯胺反应
三、特异蛋白抗原的定位与定性
免疫细胞化学 immunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对 抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有 荧光素和酶。
（一）免疫荧光法（immunofluorescent technique）：快速、灵敏、 有特异性，但其分辨率有限 如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。
显 微 操 作 仪
第二节 细胞组分的分析方法
一、离心技术
是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超
过500Kg。
（一）差速离心 Differential centrifugation
四、显微操作技术 micromanipulation technique
是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎 操作的一种方法。
包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以 及显微切割等。
– 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将 不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon （1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年， Wilmut等克隆了绵羊Dolly。
High speed
Low speed
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
（二）密度梯度离心
用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细 胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使 细胞和细胞成分分层、分离。
类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求：
（一）原位杂交（in situ hybridization）
➢ 原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交,经放射 自显影或非放射检测体系，确定特殊核苷酸序列在染色体 或细胞中位置的方法。在组织、细胞、间期核及染色体上 对核苷酸序列进行定位和相对定量研究的一种手段。
➢ 分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。最初是使用放 射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。
通过显色或放射自显影法检 测凝胶中的蛋白质成分
（三）免疫电镜技术：
免疫铁蛋白技术：铁蛋白提取繁琐，分子量大，不易进 入细胞。
免疫酶标技术：反应没有特异性，不能进行感受部位的 点对点对应。
免疫胶体金技术：胶体金是直径1-100mμm的金颗粒分 散在水中形成的 金溶胶。特异性强，容易识别。分辨 率高。
应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分 的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的 定位等
泌动态；胞内酶
免疫胶体金技术
四、细胞内特异核酸的定位与定性
分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在 适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA 杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有 互补关系。
对该基因的表达产物在细胞水平上做 出定位定量的分析
2、荧光原位杂交技术FISH （fluorescence in situ hybridization）
荧光素标记探针DNA
染色体
DNA
检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的 互补序列在染色体或DNA 上的位置
荧光原位杂交显示的人体着丝粒卫星DNA
荧光原位杂交显示的端粒
特点：
– 介质密度均一； – 速度由低向高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶
体——内质网与高基体——核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再
行分离纯化。
差速离心
Differential centrifugation
（二）Southern杂交
是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限 制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段， 经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再 用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探 针互补的特殊核苷序列。
光镜水平的原位杂交技术：同位素标记或荧光素标记 的探针 电镜水平的原位杂交技术 ：生物素标记的探针与抗生 物素抗体 相连的胶体金标记结合。
1、RNA原位杂交
放射性物质或非放射性（如地高辛、生物素）
标记特异性探针RNA
被固定的组织切片
反应
若细胞中存在与探针互补的mRNA分子
放射自显影或酶促免疫显色
（二） 蛋白电Байду номын сангаас(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应(Western-Blot)
免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹(Western blotting) 是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
原理
蛋白质
十二烷基磺酸钠(SDS)和少量巯基乙醇
显示方法
1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最 终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。
2. Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。 用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。
3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将 无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。
蛋白质中的多肽链处于伸展状态
形成SDS-蛋白质复合体
具有相同的构象
具有相同的荷质比
电泳速度由质量决定
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
原态蛋白质
Western-Blot方法：
蛋白质样品
电泳
转膜（硝酸纤维素薄膜）
非标记抗体（一抗）发 生免疫反应
荧光素酶或放射性同位素标 记的第二抗体起反应