木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
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DNA-pol Ⅱ（120kD）
核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的 末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是 有方向性的。
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DNA pol Ⅰ的校读功能
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活 性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
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三、复制中的解链伴有DNA 分子 拓扑学变化
线粒体 延长子 DNA复 链的主 制 要酶， 解螺旋 酶活性
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二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功 能实现复制的保真性
复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能 准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。
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DNA复制的保真性至少要依赖三种机制： 遵守严格的碱基配对规律；
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
• DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，即使在已发生
损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因
此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。
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（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 参与低保真度的复制 。 在线粒体DNA复制中起催化作用。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。
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-复合物由6种亚基组成：、、、、、
2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其 柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的 2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成 前导链和后随链。 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用
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DNA-pol Ⅰ （109kD）

功能： 对复制中的错误进行校读，对复制和修复 中出现的空隙进行填补。
传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但不是绝对的。
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A G G T A C T G C C A C T G G
T C C A T G A C G G T G A C C
C C A C T G G
G G T G A C C
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
目录
一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent
DNA polymerase)
简称：DNA-pol 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性
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核酸外切酶活性:
5´
AG C T T C A G G A T A

半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)
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一、 DNA以半保留方式进行复制

半保留复制的概念: DNA生物合成时，母链DNA解开为两 股单链，各自作为模板(template)按碱基配 对规律，合成与模板互补的子链。子代细 胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过 来，另一股单链则完全从新合成。两个子 细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
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子链继承母链遗传信息的几种可能方式:
全保留式
半保留式
混合式
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密度梯度实验:
含15N-DNA的细菌
培养于普 通培养液
梯度离心结果
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。

半保留复制的意义:
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA
的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗
拓扑异 构酶Ⅰ
拓扑异 构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。
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拓扑酶的作用方式：
目录
四、DNA连接酶连接复制中产生的 单链缺口

DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：
连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P
也是基因工程的重要工具酶之一。
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DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化 3,5-磷酸二酯键生成的比较
提供核糖3-OH DNA聚合酶 引物或延长中的 新链 提供5-P 游离dNTP 去PPi 结果 (dNTP)n+1
连接酶
拓扑酶
复制中不连续的两条单链
切断、整理后的两链
不连续→连续链
改变拓扑状态
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第 三 节 原核生物DNA复制过程
The Process of DNA Replication in Prokaryotes
目录
DNA聚合酶Ⅲ全酶结构
全酶结构包括：
•２个核心酶 •1个-复合物（、、 、、、 6种亚 基） •1对-亚基（可滑动 的DNA夹子）
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核心酶由、和亚基组成： 亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35外切酶活性（复制保真性 所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用 两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模 板滑动的作用
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E. Coli 基因图
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解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于 氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA 引物的酶。 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding
protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状
生物化学与分子生物学
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第十四章
DNA的生物合成
DNA Biosynthesis ( Replication )
目录
复制(replication) 是以DNA为模板的DNA 合成，是基因组的复制过程。在这个过程中， 亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则 合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸 聚合反应。
3´
| | | | | | | | | | |
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
3 5外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 3外切酶活性: 能切除突变的 DNA片段。
（一）原核生物有3种DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ
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真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较
E.Coli Ⅰ Ⅱ Ⅲ DnaG 真核细胞 功能 填补复制中的DNA空隙，DNA修复和 重组 复制中的校对，DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成 引物酶 后随链合成
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真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol 分子量（kD） 5→3聚合活性 3→5核酸外切 酶活性 功能 α 16.5 中 起始引 发，引 物酶活 性 β 4.0 ？ 低保 真度 的复 制 γ 14.0 高 + δ 12.5 高 + ε 25.5 高 + 填补引物 空隙，切 除修复， 重组
DNA-pol Ⅲ
目录
原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol I DNA-pol II 分子量(kD) 组成 分子数/细胞 5→3核酸外切酶活性 基因突变后的致死性 109 单肽链 400 有 可能 120 ？ ？ 无 不可能 DNA-pol III 250 多亚基不对称 二聚体 20 无 可能
复制 亲代DNA
子代DNA
目录

本章主要内容： DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物DNA复制过程 真核生物DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式
目录
第 一 节 DNA复制的基本特征
Basic Rules of DNA Replication

DNA复制的主要特征
The Enzymology and Topology of DNA Replication
目录

参与DNA复制的物质: 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，
简写为 DNA-pol；
模板(template): 解开成单链的DNA母链；
复制中的放射自显影图象
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ori
ter
A
B
C
A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉
C. 复制接近终止点(termination, ter)
真核生物每个染色体有多个起始点，是多复 制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间 的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是 独立完成复制的功能单位。
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。
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（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态
原核生物复制起始的相关蛋白质
蛋白质（基因） DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC) DnaG (dnaG) SSB 拓扑异构酶 (gyrA, B) 引物酶 单链DNA 结合蛋白 解螺旋酶 通用名 功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链 理顺DNA链