FL-2(-)
FITC 单标
FL2 - %FL1
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
PE 单标
FL-2(PE)
FL1 - %FL2
FL-2(PE)
After Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(-)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
非特异性染色
抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。
同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同 种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非 特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。
实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体; 同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。
侧向散射光SSC
SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
多色实验中，弱表达抗原必须设置FMO作为gating control。
双标试验中，单染管相当于FMO对照。 Treg检测中CD4/CD25/IgG即为FMO对照。
FL3 APC 4 6 10 15
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
– MACSQuantify – CellQuest
• 单参数直方图(Histogram)
• 双参数数据显示：
散点图(Dot Plot)
– Diva
4、 流式图和流式结果
流式数据的存储：列表模式（list mode），记录了每个细 胞的所有参数的信息。
Event #
1 2 3 4 ……
FSC
100 110 90 95
SSC
500 505 480 490
FL1 FITC 10 700 720 15
FL2 PE 650 700 670 720
荧光素分子 FITC PE 激发光波长 （nm） 490 488 发射光波长 （nm） 520 575 中文名 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白
PerCP
APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
490
650 496/546 496/546 495 650
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
―FSC前向散射光：反映细胞的体积大小和活力； ―SSC侧向散射光：反映细胞的颗粒度。
CD4 APC-Cy7
CD8a Alexa Fluor 700
SSC-A
FSC-A
双参数散点图比直方图更“可靠”
有的抗原荧光太弱，或背景荧光太强，双参数散点图更能反 映真实情况。
设门技巧：多用矩形门
粘连细胞的去除
前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
荧光信号
自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； 特异荧光：荧光素分子发出的的荧
光比自发荧光强很多倍。
前向散射光FSC
激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，FSC强度是d/λ的函数( λ表示波长，d指细胞大小)， 所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。
– FlowJo – WinMDI
伪彩图(Pseudo-color Plot)
等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
– FCS Express
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。
Event # 1 2 3 4
FL1 FITC
10 700 720 15
……
Counts
0…………10…………100…………1000
FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
粘连 细胞 死细胞
死细胞 或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
阈值：Threshold/Trigger
阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。 FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
FL1-FITC stain
D、 FMO对照
多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照， FMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。
Fluorescence Minus One 荧光减一对照
(-) PE
FITC
PE
补偿调节引起背景荧光增强。 颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。
设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异 性荧光，避免假阳性的结果。
001
001
002
流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电
倍增管电压越大，电子信号越强；电压越
小，信号越弱。 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度 处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相
对对照组。
B、同型对照 Isotype Control
FL2
FL1
散点图和伪彩图
等高图和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里 面的曲线代表细胞数目越多。
密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。
假三维图和三维图
Counts
SSC →
流式结果
十字门 线性门
流式分析常见问题
FSC和SSC很重要
流式分析的是单细胞，粘连细胞影响实验结果。
―周期分析时，双联体细胞的去除； ―流式分选时，粘连细胞的去除。
G0/ G1双联体细胞
G2/M细胞
FL2-H
FL2-H
FL2-A
FL2-W
FL2-W
FL2-W
电脉冲信号的面积A、高度H和宽度W
Width = Area/Height
Pulse Height
Volts
Pulse Area
0 Pulse Width
Time
Creation of a Voltage Pulse
Quantification of a Voltage Pulse
A、H和W的组合去粘连细胞
5、流式对照的设置
A、空白对照 Negative Control
细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染色的 细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。
5%
32%
默认阈值
升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
激发波长 Excitation wavelength
＜
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）； 500-549nm：绿色荧光（Green）； 550-584nm：黄色荧光（Yellow）； 585-615nm：橙色荧光（Orange）； 616-700nm：红色荧光（Red）； ≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。 标记抗体的荧光素
675
660 670 767 519 665
多甲藻叶绿素蛋白
别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不 能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。 DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上 的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA 定量染料。