染色体数目多而集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体， 而染色体数目少且分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。
其他鉴定：Ig类和亚类的鉴定；亲和力鉴定；单克隆抗体的特 异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进行鉴定
第四章抗体制药
五、单克隆抗体的大量制备
体外培养法：
（1）传统培养方法：RPMI1640培养液，10~20%小牛或胎牛 血清，但由于杂蛋白太多，纯化困难。如采用无血清培养基 （白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺），但产量低。一般 来说，可获得10 ug/ml的抗体。
SARS病毒的免疫治疗：例如钟南山提倡使用的以SARS痊愈 病人的血清来治疗SARS病人。
1937年，电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种球蛋白、乙种 球蛋白、丙种球蛋白，那么抗体属于哪一种蛋白？
第四章抗体制药
抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋 白。
第四章抗体制药
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的基本方法：取适量的脾细胞（1X108）与骨髓瘤细 胞（2~3X107）进行混合，在PEG作用下诱导融合，时间控制 在2min内，融后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。
PEG：分子量和浓度大，则促融合率高，但粘度和毒性也大。 常用分子量为4000，浓度为40~50%。为了提高融合率，也常 用DMSO来提高细胞接触的紧密性，增加融合率。
抗体=免疫球蛋白？ 抗体是生物学上功能的概念，而免疫球蛋白则是化学结构 上的概念。 抗体∈ 免疫球蛋白，免疫球蛋白≠ 抗体
例如：多发性骨髓瘤细胞也能分泌一 些同抗体分子结构类似的球蛋白，即
免疫球蛋白。
第四章抗体制药
多克隆抗体：在作为诊断试剂使用的时候，容易发生交叉免 疫反应，导致假阳性的发生。
单克隆抗体：高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产， 主要用于疾病的诊断与治疗。 诊断：例如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原、 辅助临床诊断或用放射性核素标记的单抗进行肿瘤显像。 治疗：例如针对T淋巴细胞分化抗原CD3的单抗，可用作免 疫抑制剂抑制器官移植中的排斥反应，现已上市。以单抗 为载体的药物可对肿瘤进行导向治疗。
密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，常用为
饲养细胞。
第四章抗体制药
三、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆：常用方法有ELISA，放免，荧光免疫等，经 过筛选可得到所需要的产单抗的细胞株。
阳性细胞的克隆化：指筛选得到的阳性细胞通过无性繁殖而 得到细胞集团的培养过程。一般经过3次克隆，可得到纯阳 性克隆。克隆化常用方法为有限稀释法和软琼脂法。
有限稀释法：通过有限稀释，使每孔中理论上只有一个细胞， 通过饲养细胞的帮助成长为克隆。第一次应使用HT培养基， 其后用正常培养基即可。
软琼脂法：培养基中加入0.5%琼脂，将克隆打碎后再继续培
养。
第四章抗体制药
四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞的鉴定：主要是染色体分析。正常鼠脾细胞染色体 数为40，全部是端着丝粒染色体；小鼠骨髓瘤的染色体数变异 大，多为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和亚中部着丝点 染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色 体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒。
第四章抗体制药
• 第一节 概述 • 第二节 单克隆抗体 • 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 • 第四节 基因工程抗体和抗体工程 • 第五节 抗体诊断试剂 • 第六节 抗体治疗药物
第四章抗体制药
第一节 概述
1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体治疗之先 河。 传统免疫疗法：例如现在仍在使用的破伤风抗毒素血清。
融合后的结果：脾-脾，瘤-瘤，脾-瘤及未融合的细胞。在正 常培养基中，哪种细胞生长速度最慢？
第四章抗体制药
细胞DNA合成与HAT选择培养基：
（1）主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶 酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。
（2）辅助途径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下， 经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶 （TK）的催化作用合成DNA。
第四章抗体制药
单抗介导的免疫疗法缺陷： （1）鼠原性单抗具有抗原性，容易引起人抗鼠免疫反应，从 而降低药物的半衰期。 （2）完整的抗体分子太大，不易穿透实体瘤组织。
解决办法： （1）降低单抗的免疫原性（单抗的人原化或基因工程抗体） （2）降低单抗的分子量 改进的抗体：改形抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽 （最小识别单位）。这些改进抗体许多原来的鼠源性单抗的 生物学活性消失，如激活补体、免疫调理、ADCC等，只保 留了同抗原特异性结合的活性。
第四章抗体制药
第二节 单克隆抗体
单克隆抗体的制备 一、抗原与动物免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞的培养 三、筛选阳性克隆与克隆化 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 五、单克隆抗体的大量制备 六、单克隆抗体的纯化
第四章抗体制药
第四章抗体制药
第四章抗体制药
一、抗原与动物免疫
（1）抗原的制备 （2）免疫动物的选择 （3）免疫方法： I.体内免疫法：免疫原性强、抗原量多时应用。一般在采集 脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，使对应的B淋巴细 胞克隆受到可靠的最大限度刺激后分裂增殖。 II.体外免疫法：应用于制备人源性单克隆抗体，或抗原免疫 原性极弱且能引起免疫抑制时使用。具体方法就是制备脾细 胞，进行细胞培养，加入抗原刺激，然后分离脾细胞进入融 合。
选择培养基：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）。氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常 途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的 HGPRT－细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞 具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖
饲养细胞：能释放生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞
第四章 抗体药物
第四章抗体制药
• 抗体—应用于免疫治疗与免疫诊断
▪ 免疫缺陷； ▪ 肿瘤； ▪ 感染； ▪ 自身免疫病； ▪ 超敏反应； ▪ 移植排斥； ▪ 炎症。
第四章抗体制药
抗体治疗作用机制：
• 中和毒素； • 介导溶解病原微生； • 介导溶解淋巴细胞； • 中和炎症因子； • 作为靶向性载体。