�RNA琼脂糖凝胶电泳:
配制:
1.0.5M EDTA(pH=8.0):
100ml:称取18.61g Na2EDTA·2H2O(分子量372.24),加80ml ddH2O剧烈搅拌,
用NaOH调节PH值至8.0(约需2g NaOH).高压灭菌,室温保存。
2.50×TAE loading buffer:(Tris acetate-EDTA buffer)电泳缓冲液
组分:2M Tris-乙酸;100mM EDTA(pH=8.0)
500mL:称121.1g Trisbase(分子量121.14),加800ml ddH2O溶解,加57.1ml
乙酸和50ml0.5M EDTA溶液(pH=8.0),搅拌,ddH2O定容至500mL.室温保存。
3.1×TAE loading buffer:
取20ml50×TAE,ddH2O定容至1L.室温保存。
4.100×Sybergreen:
500ul:取495ul1×TAE于1.5ml离心管,加入5ul Sybergreen原液混匀,4℃锡纸
避光保存。
注意:Sybergreen原液需稀释10000倍;
6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍,最终稀释倍数应不小于1×。
步骤:
1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml,我们用30ml):
称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中,加入30ml1×TAE,瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次,至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液。
2.胶板制备:
取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子.
将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.
3.加样:
样品制备:(10ul体系/样品槽)于0.25ml离心管中
样品RNA(最后加):2ul/3ul/5ul
6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul
100×Sybergreen:0.1ul
DEPC水:至10ul
(注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.
4.电泳:
加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.
5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯(trans UV)下观察拍照
保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带:28,18,5.8。
28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊,可有可无。