实验一细菌淀粉酶和过氧化氢酶定性测定一、实验目的①了解过氧化氢酶试验的反应原理和用途。

②了解淀粉酶试验的反应原理和用途。

③通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。

二、实验原理酶是微生物机体内生物合成的一种生物催化剂，它是高分子蛋白质，具有催化生物化学反应加速进行，并具有传递电子、原子和化学基团的作用。

微生物的酶按它所在细胞的部位分为胞外酶、胞内酶及表面酶。

本实验对胞外酶中的两种即淀粉酶和过氧化氢酶(亦叫接触酶)进行定性测定。

细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖，淀粉被酶催化分解后用碘检测不到其变色现象；过氧化氢酶能将过氧化氢快速分解为水和氧气，能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。

三、实验仪器和试剂①试管(15mm-150mm)5支、试管架1个、培养皿(90mm)3套、接种环。

②肉膏胨淀粉琼脂培养基(1L) : 蛋白胨10g、Nacl 5g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、琼脂15g、蒸馏水定容到1000ml 121℃灭菌20min。

③4％淀粉溶液1滴瓶:4g可溶性淀粉加水至100ml④革氏碘液1滴瓶:碘1g、KI 2g、蒸馏水300ml （将I与KI先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

⑤9％过氧化氢1滴瓶：30％过氧化氢30ml 蒸馏水70ml⑥枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。

⑦活性污泥四、实验方法(一)生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的测定①取3支干净的试管，按1、2、3对照编号。

放在试管架上备用。

②在1号、2号试管内分别加入5ml、10ml的活性污泥混合液，再在1号和2号试管中分别加10 ml和5 ml蒸馏水。

在对照管内加15 ml 蒸馏水。

③在1号、2号、3号及对照管中分别加入4％的淀粉液4滴(淀粉液的用量，在做预备实验时根据样品中淀粉酶含量多少而定)，迅速摇匀并记下反应的初始时间。

④在上述3个管内分别加4滴碘液(碘液用量在预备实验时酌定)，迅速摇匀，这时各管均呈蓝色。

⑤观察结果。

注意各管的变化，记下各管蓝色完全消失时的时间(即淀粉酶和淀粉反应完全的时间)，并对结果进行分析。

(二)细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验①将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45℃左右倒入无菌培养皿内(每皿约10 ml)，共倒3个，静置待冷凝即成平板。

②在无菌操作条件下，用接种环分别挑取枯草杆菌、大肠杆菌和活性污泥各一环分别在3个平板上点种5个点。

倒置于37℃恒温箱内过夜培养。

③观察结果，取出碘液，分别在3个平板内菌落周围滴加20ul碘液，观察菌落周围颜色的变化。

若在菌落周围有一个无色的透明圈，说明该细菌产生淀粉酶并扩散到基质中去。

若菌落周围仍为蓝色，说明该细菌不产生淀粉酶。

(三)过氧化氢酶的定性测定①将配备的斜面培养基接种枯草杆菌、大肠杆菌37℃恒温箱内过夜培养。

②用滴管吸取过氧化氢滴加入到菌落上，观察菌落是否有气泡。

五、实验报告把所观察到的现象记录下来，进行分析。

六、思考题①淀粉酶定性测定中对照应呈什么颜色?为什么?各菌落呈什么颜色?为什么?②各菌落滴加过氧化氢后呈什么现象?说明什么问题?实验二处理生活污水的活性污泥微生物总DNA的提取一、实验目的：①掌握环境样品DNA提取技术。

②掌握琼脂糖电泳的检测原理和方法。

二、实验原理：活性污泥是一种以好氧性细菌为主体的微生物和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主体。

环境样品的微生物总DNA的提取和纯化方法主要由两部分组成：1.温和裂解细胞及溶解DNA的技术，包括物理、化学或酶解作用裂解细胞，是DNA释放出来。

2.在环境样品DNA得到充分释放后，通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、RNA及其他的大分子。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子分离，把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光，EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物。

三、实验仪器和试剂：仪器：核酸电泳系统，凝胶成像分析系统，离心机，移液器，水浴锅，涡旋振荡器，EP管。

试剂：1、0.1%磷酸钠缓冲液（PH 8.0）100ml ：1M Na2HPO4 93.2ml、1M NaH2PO4 6.8 ml，加热配制。

2、溶菌酶。

3、20% SDS 100ml：20g SDS 加灭菌水定容至100ml，加热。

4、70%乙醇：70ml无水乙醇，加灭菌水30ml。

5、TE缓冲液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul，0.2M EDTA 250ul，灭菌水49250ul6、异丙醇，7、8mol/LKAc溶液：392.56g KAC 加灭菌水500ml，121℃灭菌20min。

8、1kb DNA分子量标准。

9、1%琼脂糖：0.5g 琼脂糖加5ml 10×TBE，45ml水。

10、10×TBE：Tris-base 54g、Boric Acid 27.5g、Na2EDTA 4.65g 加蒸馏水定容至500ml，用HCL调PH 8.311、核酸上样缓冲液：10×ladder四、实验方法：1、取1g活性污泥，离心12000rpm 3min 去上清，灭菌水洗涤2次，10000rpm 3min,去上清。

加1ml 0.1mol/L PH8磷酸钠缓冲液,漩涡震荡器震荡20min。

2、加溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml，振荡5min,37℃水浴30min。

3、加120ul20%SDS轻柔振荡15min，6000rpm离心10min。

4、取上清液加0.2倍体积冰冷的8MKAc，颠倒混匀1min，12000rpm离心10min。

5、吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀1min，室温下放置10min，12000rpm离心10min。

6、去上清，加1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀，12000rpm离心2min，去乙醇后于37℃干燥 10min。

7、重复做第6步8、每管加100 ul TE+400ul灭菌水+0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。

9、弃上清液，将沉淀定容于200ulTE缓冲液中，加0.2倍体积8MKAC，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm离心10min。

10、吸取上清液移到新的EP管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min。

11、弃上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀、12000rpm离心10min，干燥，溶于200 ul TE缓冲液中。

12、吸取20ul DNA溶液，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA提取效果。

加上1kbMaker作为DNA大小的标准。

五、实验报告把在1%琼脂糖凝胶观察到的现象记录下来，进行分析。

六、思考题①SDS和乙酸钾的作用?②不同浓度的琼脂糖凝胶电泳的分辨率?实验三微生物总DNA中的16SrDNA PCR扩增技术一、实验目的①了解以通过引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理②掌握从活性污泥微生物总DNA中进行16SrDNA PCR扩增的方法二、实验原理RCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物PCR 由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。

在本实验中，PCR扩增的模板是从活性污泥中提取的微生物总DNA，扩增的目的序列是微生物16SrDNA的V3区。

采用的引物是细菌的一对通用引物，正向引物338F:5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCG CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。

反向引物518R：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。

其中，正向引物338F的5’端连接有40bp的GC 发夹，以增加DNA解链区的GC含量，提高解链温度。

三、实验仪器和试剂①样品从活性污泥中提取得到的微生物总DNA。

②仪器及相关用品PCR扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需的设备，凝胶成像分析系统，移液枪及吸头，PCR管，高速离心机。

③试剂Taq DNA 聚合酶，10×PCR反应缓冲液，MgCl2 25mmol/L,四种dNTP混合物各为2.5mmol/L。

引物：正向引物及反向引物（浓度为25pmol/L），灭菌的去离子水。

模板：从活性污泥中提取得到的微生物总DNA，用灭菌的去离子水稀释10倍后用作模板进行PCR扩增。

1kbDNA分子量标准：1.0％琼脂糖；核酸上样缓冲液。

四、实验方法1.建立PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系总体积为50ul，向PCR反应管中依次加入以下试剂：10×PCR反应缓冲液5ul；dNTPs 2ul；MgCl25ul；引物各1ul；模板1ul；Taq DNA 聚合酶2.5U; 去离子水35ul。

在做上述实验的同时，以去离子水代替扩增模板做一次阴性对照。

2．设置PCR反应条件95℃（5min）→｛95℃（1min）→55℃（1min）→72℃（1min）｝35个循环→72℃（10min）→4℃备用3.电泳检查结果PCR反应结束后，取5ul反应液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测扩增产物。

DNA上样时，加上DNA分子量标记作为判断PCR 产物大小的参照物。

五、实验报告1.简述通用引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理2.进行结果和观察、记录与分析。

六、注意事项1.在配制PCR反应体系的过程中，应在加入dNTP混合物后再加入Taq DNA 聚合酶，因为有些酶的3’→5’外切酶的活性较强，如果反应体系中不含dNTP，可能导致引物分解。

2.应对吸头和PCR管进行高压灭菌，每次操作前必须更换吸头，以免试剂相互污染。

七、思考题1.以细菌通用引物进行16SrDNA PCR扩增的目的是什么？2.影响PCR扩增效率的因素有哪些？3.如果出现非特异性的DNA条带，可能的原因有哪些？实验四土壤中微生物数量的监测一、实验目的①学会土壤悬液的稀释方法②掌握土壤微生物数量的检测方法二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境，它具有微生物所需的一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件，所以土壤中的微生物的数量和种类都很多，它们参与土壤中的氮、碳、硫、磷等的矿化作用，使地球上的这些元素能被循环使用。