第三章 NMR 实验技术基础4 脉冲技术a 频偏效应(off-resonance effects)由于射频场为单色波，而样品中的化学位移有一定的范围，因此不同的核感受到的有效场也不同。

(1) 脉冲作用对象为Z 磁化向量 在off-resonance 状态，相位y 的脉冲作用于平衡态的z 磁化向量后：M M M M M M x y z ==-=+000221sin sin ;(cos )sin cos ;(cos cos sin )αθαθθθαθ当频偏大时有明显的相位及强度的畸变：tan (cos )cos sin (cos )sin sin βαθααθαγ==-=-⋅-M M B yx 111Ω这个式子适合于分析相位与频偏的关系。

当频偏不大于射频场频率时，90度脉冲后的水平分量的相位与频偏基本上是线性关系，βγτγττπ=-=-=-ΩΩΩB B 190190902 因此不太大的频偏下，实际的90度脉冲可以当成理想的90度脉冲，后跟一段演化期，时间长度为ττπ=290相比之下，有频偏时180度脉冲的效果要差的多，通常需要其他技术来弥补。

90度脉冲的激发曲线的第一个零点位于Ω=±151γB180度脉冲的激发曲线的第一个零点位于Ω=±31γB如蛋白质中C α的化学位移平均在56ppm 左右,而CO 的化学位移在174ppm 左右，若要激发其中之一同时对另一个影响最小，180度方波的功率应选择为1181256738562⨯=.Hz ,对应的脉冲宽度大约58.4μs.(2) 脉冲作用对象为水平磁化向量(nonresonant effects) 频偏较大时射频场的有效磁场接近Z 向，因此横向磁化向量在脉冲期间绕Z 轴有额外的进动，产生相移：φωτNR pt =<>122()Ω此处<>对脉冲串作平均，在多维谱中当τp 随间接维时间变化时（如去偶序列），这个相移在对应的间接维中表现为一个频移ωωNR t =<>122()Ω该图显示的是脉冲宽度58.4 s 的180度脉冲对横向磁化产生的额外相移。

b 组合脉冲(composite pulse) 一般脉冲都受频偏，射频场不均匀等的影响，特别是180度脉冲。

利用几个脉冲组合在一起，完成一个所需的旋转，就是组合脉冲。

其设计多样，目的不尽相同。

其效果往往同初始状态有关。

作用于Z 向的180度脉冲最简单的可用90x 180y 90x 代替。

效果见图3.20(p.140)c 自旋去偶 在异核实验中，一个核的演化过程中另一个核加连续波照射，可产生去偶效应，但所需的功率太大。

而在一个回波序列中若仅有一个核加180脉冲而与其有J 偶合的另一核不加脉冲，则在回波点上J 偶合不起作用，但回波期间仍起作用。

若将整个期间分成许多短的回波序列，J 偶合起作用的时间相对减少，极限情况下，一连串180脉冲期间，J 偶合起作用的时间更少，这时就起到自旋去偶的作用。

由于180脉冲的性能不佳，通常用组合脉冲来代替180脉冲。

并加上各种循环使其效果更好。

若R 代表180度组合脉冲，R 代表这个组合脉冲中所有脉冲的相位均反转的结果，下面的超循环产生更好的效果： RRRRRRRRR RRRRRRRR RRRR RRRR RRRRHz 1200040000-4000-1200(1) WALTZ 系列，基本单元是90x 180-x 270x ,记为123 如W ALTZ-16:342312423342312423342312423342312423(2) GARP 序列，更多的组合脉冲去偶要靠computer optimizationGARP 序列由RRRR 组成，其中R 为： 30.5 0 55.2 180 257.8 0 268.3 180 69.3 0 62.2 180 85.0 091.8 180 134.5 0 256.1 180 66.4 0 45.9 180 25.5 0 72.7 180 119.5 0 138.2 180 258.4 0 64.9 180 70.9 0 77.2 180 98.2 0 133.6 180 255.9 0 65.5 180 53.4 0d 选择脉冲 在许多核磁实验中需要选择激发或选择抑制技术。

最简单的选择脉冲是低功率的方波（软脉冲）： 图中可见，方波激发有效范围大约-≤≤2211ωωΩ,缺点在于激发有相当的边带。

核磁谱仪的发展是引入成形脉冲发生器，将一个脉冲分成几百甚至几千个方波脉冲，每步的强度及相位均可控制，这样可以产生不同的激发曲线。

但直至今日，要产生完全理想的选择激发仍是非常困难的。

0.006J scaling factor fo r GARP-1Hz 30000100000-10000-30000图中可见，Gauss 成形脉冲的选择性较方波好，但相位受频偏的影响较大。

此图仍然是同一个Gauss 成形脉冲，但每个小脉冲的相位加一个线性变化，其激发曲线的形状不变，但激发峰点移动。

参见图3.23-3.25(pp.147-149)Hz600020000-2000-6000Hz600020000-2000-6000此图显示的是一种所谓绝热脉冲的形状，其特征是相位迅速变化，而且是非线性的，因此射频激发的瞬间频率从激发谱的一端扫描到另一端，在脉冲作用期间，一个核感受到的有效场矢量从Z 向转向－Z 向，其扫描速度慢于核磁矩绕有效场的进动频率即所谓绝热条件，在这种情况下，核磁矩与有效场矢量同步地运动，也从Z 向转向－Z 向，而受频偏的影响很小，所以作为180度宽带选择脉冲是非常理想的。

由图中可见其激发频谱非常宽而且边界变化快。

最近几年对绝热脉冲的研究相当多，不断有新的脉冲形状被设计出来。

5 水峰抑制技术 生物样品如蛋白质和核酸的核磁实验通常要在水中进行，因为生理环境是水溶液。

而水的浓度达110M ，因而水峰信号的抑制成为实验成功的一个关键。

水峰信号的特点： a 强度大，较一般生物样品高出4－5个数量级，导致ADC 饱和 b 水的强信号有一个新的现象，即radiation damping: 水的横向磁化向量在探头的线圈中诱发出感生电动势，由于此电动势极强，又与水的横向磁化向量本身作用，使其快速返回到Z 向，其时间常数为τπγRD M Q =120,因此虽然水本Hz 600020000-2000-6000身的T 1时间在秒的量级，radiation damping 使其信号回复到Z 向的时间仅有几十毫秒，这样也使水峰变得很宽。

c 水信号还能同样品中的活泼氢交换 解决措施：a 利用高纯度重水，还可进行重氢交换实验，但最终所有可交换的活泼氢都消失，其中包括对结构解析非常重要的NH 质子b 预饱和c 选择激发d 选择抑制e 数据处理 (1) 预饱和 最基本，最简单的方法，通常在脉冲的弛豫恢复期间加低功率的射频照射(大约50Hz 左右)，持续1－2秒，这种方法对蛋白质可用，但有一定条件: 通常蛋白质主链上的NH 与水的交换在pH3附近最慢，因此用于记录核磁谱的蛋白质溶液的pH 一般调节在3－5之间，尽管在这样条件下，N 端的NH 由于与水交换太快，加射频照射时的饱和转移也使N 端的NH 被饱和而不能观察到；若pH 在中性附近乃至碱性，则交换太快，而不能用预饱和。

核酸碱基上的氨基及亚氨基尤其是亚氨基与水的交换较蛋白质高出1－2个数量级，加上核酸结构中的氢键在中性附近才稳定，一般溶液的pH 在7左右，因此核酸的核磁实验不能用预饱和。

水峰抑制的效果同样品的磁场均匀程度有很大关系，也与样品本身的性质如黏度等有关。

(2) Jump-return/Binomial sequences属于选择激发，但水峰抑制程度偏小，适用于比较简单的脉冲序列。

常用的有11-,13---等。

(3) spin-lock/gradient pulses 参见图3.28(p155)尤其是WA TERGATE 及water flip-back 技术效果较好，在多维谱中用的很多 6 一维谱的一般步骤a 样品准备 样品要求可溶，通常样品管装样量为0.4-0.6ml,一般用5mm 样品管，标记样品特别是大蛋白要有1－2mM,非标记的小蛋白可更高一些。

样品必须离心，除去悬浮颗粒，不能有顺磁性的污染。

样品在所用溶液状态下必须足够稳定，因为核磁实验经常要数周至数月时间。

由于不同pH ，不同温度下样品中化学位移的分散程度不一，尽量寻找最佳条件。

a1Hb1HcG zd1H G z很多蛋白质的一定条件下特别是浓溶液中会聚集，形成多聚体，要尽量避免。

b 调谐 线圈在插入样品管后要影响其谐振状态包括品质因子等，所以实验前首先要调节探头状态，使其谐振频率对准所用的射频频率，同时探头的输入阻抗与放大器的输出阻抗匹配，这样才能将射频能量有效地传送到探头，否则反射回去的能量会损坏放大器等。

c 锁场 所有样品必须含有锁场介质，现代谱仪一般都用氘锁，所以即便是水溶液，也要加5-10%的重水。

锁场既提供场频连锁机制，及时补偿磁场的漂移，也为匀场提供一个手段。

d 匀场 就是调节室温匀场线圈的电流，使磁场尽量均匀。

判别匀场好坏的标准通常用锁场信号的强弱或直接观察FID 的形状。

e 脉冲宽度的校正 不同样品特别是氢的90度脉冲宽度不一样，脉宽正确与否对简单的一维谱关系不大，但对二维三维谱很重要，必须仔细测量。

通常观测180度或360度脉冲的效果来测量90度脉宽。

谱仪上表征射频场功率强度用衰减分贝（Bruker 仪器），即分贝值越大，射频功率越小：dB P P V V ==102010121012log ()log () 此处P 为功率，V 为电压，由于产生的磁场强度与电压成正比，核磁矩围绕磁场进动的频率又与磁场强度成正比，因此此处V 可用进动频率代替。

而进动频率的倒数即周期或360度脉宽，故两个90度脉冲宽度的比值的对数乘以20就是这两个脉冲功率的分贝值之差。

记住：这个分贝是衰减分贝。

这样可以从一个功率下的脉宽推算其他功率下的脉宽，实际的脉宽会有一些差别，这要视仪器的线性程度。

通常氢的脉冲宽度可直接观测来测定，其他通道的核的脉宽可直接测（需要浓样品或标记样品），或间接测(图3.33, p171)f 循环延迟 一般要大于T 1,对小肽需要1秒多，大蛋白质小于1秒即可。

g 定标 早期核磁实验一定要有定标物质（或内标，或外标），现代数字化谱仪可以精确确定射频场频率，可以由锁场信号的位置间接计算。

一般生物样品溶于水中，同时为水峰抑制缘故，射频场频率常放在水峰位置，可以水峰位置定标，但由于水峰位置同pH,温度特别是温度有关，需要作校正：25︒C 下水的化学位移为4.766ppm,温度系数为-11.9ppb/︒C 其他通道的共振频率的校正可通过下法进行： 各通道的0ppm 的绝对频率之比为各种核的γ之比（因实验时各种核感受的磁场强度一样），这个比值已有非常精确的测量值，因此由一个通道（通常是H 通道）的标准位置（如水峰位置）就可计算实验所用到的所有通道的定标。