实训八病毒的鸡胚接种技术
目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。

仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。

方法与步骤（实验视频六）
（一）鸡胚的选择和和孵化应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。

为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。

用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。

孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。

每日最少翻蛋3次。

发育正常的鸡胚照蛋时可见清晰的血管及鸡胚的活动。

不同的接种材料需不同的接种途径（见图2-4），不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。

卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。

（二）接种前的准备
病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h，高速离心，取上清液，或经细菌滤器滤过除菌。

如为患病动物组织，应剪碎、匀浆、离心后取上清液，必要时加抗生素处理或过滤除菌。

若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。

照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。

尿囊腔接种选9～12日龄的鸡胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管。

（三）鸡胚的接种（以新城疫病毒的绒毛尿囊腔接种为例）在接种部位先后用5%碘酊棉及75%酒精棉消毒，然后用灭菌锥子打一小孔，一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室,刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。

注射后,用熔化的蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。

孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。

弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。

（四）鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。

绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。

将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。

用灭菌镊子夹起并撕开或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。

然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊说明有细菌污染。

收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。

用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然后弃掉。

注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。

操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。

病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。

思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？
2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？
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