（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
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三、几种重要的PCR衍生技术
（一）逆转录PCR技术
• 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RTPCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合 应用的一种技术。 • RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因 以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分 析的最有一定条 件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的 cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形 式贮存着该组织细胞的基因表达信息。
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生物芯片技术
Biological Chip Technique
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一、基因芯片
基因芯片(gene
chip)
CO-IP与质谱分析流程
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二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术
（一）电泳迁移率变动测定
电泳迁移率变动测定 (electrophoretic mobility
shift assay ， EMSA) 或 称 凝 胶 迁 移 变 动 实 验 (gel shift assay) 最 初 用 于 研 究 DNA 结 合 蛋 白 与 相 应 DNA 序列间的相互作用，可用于定性和定量分析， 已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技
术也被用于研究 RNA 结合蛋白和特定 RNA 序列间
的相互作用。
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凝胶迁移实验结果示意图
未标记探针 核蛋白提取物 标记探针
10X
1X
1X
10X 1X
10X 1X
1X
结合有蛋白的探针
放 射 自 显 影
未结合探针
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（二）染色质免疫沉淀法
染 色 质 免 疫 沉 淀 技 术 (chromatin
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（二）基因突变
利用 PCR 技术可以随意设计引物在体 外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突 变等改造。
（三）DNA和RNA的微量分析
PCR 技术高度敏感，对模板 DNA 的 量要求很低，是 DNA 和 RNA 微量分析的
最好方法。
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（四）DNA序列测定
将 PCR 技术引入 DNA 序列测定，使测序 工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测 DNA 片段既可克隆到特定的载体后 进行序列测定，也可直接测定。
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人眼及各类显微镜分辩率
• 人眼分辩率
0.20mm
• 光学显微镜分辩率
• 共焦显微镜分辩率
0.25um
0.18um
• 电子显微镜分辩率
0.20nm
• 激光共聚焦显微镜有四个荧光通道，一个透射 光通道
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激光共聚焦显微镜的应用
• 定位、定量 • 三维重组 • 动态测量
活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位
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二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
• 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成 为“诱饵”表达质粒，录
（三）免疫共沉淀技术的基本原理和用途
• 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）
免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利
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（三）实时PCR技术
实时PCR(real-time PCR)技术通过动态 监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积 对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。
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实时PCR技术原理
荧光标记引物
3'
R
Q
5'
上游 引物
5'
下游 3' 引物
R
3' 5'
Q
5' 3'
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实时PCR分类：
非探针类 实时PRC 1. TaqMan探针法 2. 分子信标探针法 3. FRET探针法
immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可
以研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的 主要方法。
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染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图
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二、RNA-蛋白质相互作用分子分析技术
RNA 结 合 蛋 白 免 疫 沉 淀 （ RNA Binding Protein Immunoprecipitation ， RIP），是研究细胞内RNA与蛋白结合 情况的技术。 应用范围：
探针类
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图20-3 TaqMan探针法实时目录基因(genelibrary)
是指一个包含了某一生物体全部D
（二）原位PCR技术
• 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片
上的单个细胞内进行的 PCR 反应，然后用特异
性 探 针 进 行 原 位 杂 交 ， 即 可 检 出 待 测 DNA 或
RNA是否在该组织或细胞中存在。 • 原位 PCR 方法弥补了 PCR 技术和原位杂交技术 的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的 一种最佳方法。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
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分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization and
Blotting Technique
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用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体 系沉淀下来。
• 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋 白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相 互作用的有效方法。
• CO-IP与质谱分析
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其他：
斑点印迹 (dot blotting)
原位杂交 (in situ hybridization)
DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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②
①
③
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
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DNA芯片 技术
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PCR技术的原理与应用
以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免 疫共沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白 的结合蛋白
目录
免疫沉淀原理图解
目录
免疫共沉淀原理图解
目录
免疫共沉淀原理图解
IP
CO-IP
C
C
A
A+B D
蛋白A ， 蛋白B 抗A抗体C进行洗脱 抗B抗体D进行验证
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合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结
合的未知分子。
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标签融合 蛋白沉淀 实验流程 示意图
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（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途
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酵母双杂交系统的应用
• 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用
的生物信息学推测。
• 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的
相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。
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复性
RNA
DNA
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（一）印迹技术
利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子 转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因 此称之为“blotting”，译为印迹技术。
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（二）探针技术
用放射性核素、生物素或荧光染料标记其 末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为 “探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷 酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
研究蛋白与DNA动态作用 研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系 研究蛋白与RNA的相互作用
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激光共聚集显微镜应用技 术
Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)
目录
激光共聚焦显微镜工作原理示意图
激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。
• 耐热DNA聚合酶
• dNTPs
• Mg2+
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二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以 cDNA 或基因组 DNA 为模板获
得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直
接以组织和细胞的mRNA为模板获得目 Principle and Application of
PCR Technology
目录
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5
5
5
Cycle 2
5
5
5 5
5 5
5
5
目录
Cy的编码区和非编码区）以DNA
片段形。目录基因组和cDNA的构建和筛选目录
基因组筛选结果举例第一轮筛选第二轮筛选
第三轮筛选
是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排
列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧