Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
使用注意
二、DNA连接酶和DNA分子的体外连接 1、DNA连接酶 : 1967年首先发现，能催化2 条DNA链之间形成磷酸二酯键。
根据来源分： ①大肠杆菌 ②T4噬菌体
视频
二、核转移技术
核转移技术
即 动 物 整 体 克隆 技术 ， 将动 物体 细胞 核 全 部 导 入 另 一个 体 的 去 胞 核的 受精卵 内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 例：英国克隆羊多利
三、基因剔除技术
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA）
一、质粒(plasmid)载体
1、基本特征： 2、类型：F、R、Col 3、命名：例 pBR322 4、 pBR322质粒载体的特点
第二节 分子克隆常用载体
二、噬菌体载体
1、一般特征：是一类细菌病毒的总称，结构 比质粒复杂，感染效率很高。 2、λ噬菌体：
探针种类： DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
基因组DNA探针 来源 克隆化的基因片 段 （1）制作方法 简便，易获得 （2）不易降解 （3）标记方法 优点 成熟
cDNA探针
RNA探针
寡核苷酸探 针 人工合成 （1）链短， 杂交时间短 （2）对单核 苷酸变化敏 感
RNA的逆转录 mRNA、病毒 RNA （1）不含内 含子 （2）杂交特 异性高 （1）杂交体稳定 （2）不存在互补 双链的竞争性结 合 （3）杂交特异性 高 （4）杂交后本底 低 （1）易降解 （2）标记方法较 复杂 （3）polyA影响 杂交特异性 基因表达，尤其 是转录水平
原位杂交 (in situ hybridization) 斑点印迹 (dot blotting) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
第四节 多聚酶链反应 (Polymerase chain reaction) PCR
Dr. Karry Mullis 1985年发明， 获1993年度诺贝尔化学奖。
DNA测序自动化
DNA自动测序结果
第六节 遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
一、转基因技术
转基因技术
采 用基因 转 移 技术使 目 的基因 整 合 入受精 卵 细胞或 胚胎干 细胞 ，然后 将细胞导入 动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物
缺点：灵敏度低 特异性较差
核酸分子技术路线
核酸探针 标记、纯化 液相杂交 固相杂交 靶核酸 预处理 分离纯化 原位杂交 探针-靶反 应 杂交信 号检测 限制性酶切
纯化杂交体 放射性核 素检测 非放射性杂 化分子检测
（二）、印迹技术的类别及应用
1、DNA印迹技术 (Southern blotting)
1. 凝胶电泳分析 凝胶电泳可以帮助判断扩增产物 的大小及产量 2. 酶切分析 既能进行产物鉴定，又能进行基因分 型，还能进行变异性研究 3. 分子杂交分析 分子杂交是检测PCR产物特异性 的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效 方法 4. 测序分析 DNA测序是检测PCR产物特异性的最 可靠方法，不仅能进行基因分型，还能进行变异 性研究
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同功异源酶
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG BstⅠ GGATCC CCTAGG GATCC G + G CCTAG G GATCC + CCTAG G
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割 DNA 后，产生相同的粘性末 端，称为 同尾酶。这两个相同的粘性末端称 为配伍未端(compatible end)。
2、DNA体外连接
三、其他工具酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶 2、耐热DNA聚合酶（Taq酶） 3、逆转录酶 4、甲基化酶：将某些限制位点甲基化，使 DNA不再被某些限制酶切割，在制备重组 DNA时用于修饰目的DNA内部的一些限制位 点，保护目的DNA。
第二节 分子克隆常用载体
克隆(clone)
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
三、其他载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
载体分类：
转染 transfection 用病毒或病毒DNA感染细胞。 转导 transduction 以噬菌体为媒介，转移遗传物质。 转化 transformation 以质粒将外源性DNA引入细胞的过程。
琼脂糖凝胶电泳
五、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
第 五 节 核 酸 序 列 分 析
Nucleic Acid Sequence Analysis
核酸序列分析的基本原理
DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
（二）引物
⒈引物严格特异 ⒉引物之间没有互补性 ⒊引物内部避免形成二级结构 ⒋引物的长度合适、引物的浓度合适、引物 的质量好
（三） Taq酶
Taq DNA聚合酶具有以下特点： ①遵循碱基互补原则，按5‘→3’方向合成DNA新 链； ②有5’→3’外切酶的活性，但无3’→5’外切酶的活 性； ③具有逆转录酶活性，但该活性依赖Mg2+或 Mn2+； ④具有类似末端转移酶的活性，可以在新生链的 3‘端加接一个不依赖模板的核苷酸。
克隆化(cloning)
获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。
技术水平： ①分子克隆(molecular clone)，即DNA 克隆 ②细胞克隆 ③个体克隆（动物或植物）
DNA克隆
视频
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人 工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能 力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子， 也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA等） 。
第三节 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
一、基本原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA 单链分子放在同一溶液中，或把DNA与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链 分子之间有一定的碱基配对关系，就可以 在不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
（四）dNTP
dNTP是PCR的底物，其浓度、比例和质量 与反应效率和特异性密切相关： ①浓度过高可以加快反应速度，但也会导致 错配率升高；浓度过低虽然可以提高反应 的特异性，但会降低扩增效率 ②四种dNTP的摩尔浓度要相等 ③dNTP溶液通常小量分装置－20℃冰冻保存
（五）Mg2+
Mg2+可以影响解链温度、退火温度、扩增 效率、扩增特异性和引物二聚体的形成等 值得注意的是，Taq DNA聚合酶需要的是 游离的Mg2+ ，而PCR体系中的dNTP、引 物和模板的磷酸基都可以和Mg2+结合，从 而降低游离Mg2+的浓度。
基本原理
DNA加 热变性
DNA冷却 复性
DNA/RNA 杂交
变性
复性
RNA
DNA
二、核酸分子杂交的基本分类
DNA-DNA杂交 杂交 DNA-RNA杂交
杂交的基本分类
根据杂交介质的不同 液相杂交 固相杂交 原位杂交 基因芯片技术
三、核酸分子杂交与印迹技术
（一）、核酸探针
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标 标记 其末端 或 全 链 的 已知 序列的 多聚 核 苷 酸，与 固 定 在 NC 膜上 的核 苷酸结 合，判断 是否有同源的核酸分子存在。
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。
2、RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
3、蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
三种印迹
② ②
① ③
分子杂交探针实验
放 射 自 显 影 照 片
（三）、其他
3、分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
4、 II 型限制酶的特点 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
PCR理论扩增效率
二、PCR体系基本组成成分
n n n n n n
模板DNA 特异性引物
耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
缓冲液
（一）模板