新型药物载体免疫脂质体的研究进展 08药剂3班乔宇 20080702067免疫脂质体(immunoliposomes)是单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb，简称“单抗”)或其片段修饰的脂质体的简称，这种新型药物载体对靶细胞具有分子水平上的识别能力，具有很多优势，包括对肿瘤靶细胞呈现明显的选择性杀伤作用，且杀伤活性比游离药物、非特异抗体脂质体、单独单抗等更强；在荷瘤动物体内呈特异性分布，肿瘤病灶药物浓度升高，药物毒副作用较小；体内循环半衰期长及运载药物量大等。
免疫脂质体发展至今经历了数代：第一代是抗体或抗体片断直接与脂质体的脂膜相连，但由于巨噬细胞的吞噬很快被血液清除；第二代在第一代的表面引入了聚乙二醇(PEG)等亲水性大分子，延长了在血液中的循环时间，但PEG长链对单抗的屏蔽使抗体与靶细胞的结合能力降低；第三代将抗体连接在PEG或其衍生物的末端，制成空问稳定性免疫脂质体(sterically stabilized immunoliposomes，SIL)，延长了包含药物的脂质体的血液循环时问，且单抗伸展至脂质体外部发挥寻靶作用。
本文就免疫脂质体的分类、抗体连接脂质体的方法、临床应用及其发展现状进行综述。
1 免疫脂质体的分类根据靶向特异性细胞和器官的原理可将免疫脂质体分为抗体介导和受体介导两类。
1．1 抗体介导的免疫脂质体抗体介导的免疫脂质体是利用抗原一抗体特异性结合反应，将单抗与脂质体偶联。
抗体有单克隆抗体和多克隆抗体之分，单抗因其专一性在抗体应用中占主导地位。
现今，全世界已有超过1 50种单抗应用于临床或正处于临床研究阶段，且也已从原先的纯鼠单抗发展为人鼠嵌合抗体及人源化抗体，如已上市的人源化单抗Daclizumab、Palivizumab、Trastuzumab等；临床应用中，单抗从最初治疗器官移植排斥反应、降凝血发展到治疗癌症、HIV感染等疑难性疾病[2】。
1．1．1 两种抗体修饰的双靶向免疫脂质体靶向物用两种不同的抗体修饰脂质体，可增加其结合特异性和细胞摄取率，并且抗体在靶向细胞时能产生协同作用【3】。
Laginha等【4]假设脂质体通过抗体靶向到两种或多种受体时，由于受体密度增加，靶向效果会更好，并用荧光测定分析法验证了这一假设的正确性。
这项实验中，分别制备了连接相同密度抗体的aCD19靶向脂质体、etCD20靶向脂质体、两种脂质体混合物(混合比例为1：1)及双靶向脂质体，证实了双靶向脂质体和混合脂质体较单个抗体修饰的脂质体和受体有更大的结合率和摄取率，且出现加和性；细胞毒性实验中，装载有阿霉素的双靶向脂质体较这两种脂质体混合物有更高的细胞毒性。
Saul等【5]以阿霉素为模型药物，用叶酸和抗表皮生长因子的单抗修饰脂质体，同时靶向两种受体，使药物更多地聚集于肿瘤靶位，降低了对正常组织的毒性。
1．1．2 抗体片段修饰的免疫脂质体虽然抗体对靶点具有高选择性，但持续给药时，患者往往会出现免疫反应，特别是应用外源性抗体f如鼠)时免疫反应加剧。
而抗体片段Fab。
(55kDa)、单链抗体可变区基因片段scFv(35kDa)产生的免疫原性比整个单抗低，且更易控制其性质(如亲和力或被细胞摄取的能力)，故在临床试验中应用较多。
如抗表皮生长因子受体(HER2)Fab’比应用整个抗体的免疫原性低，且在体内具有更好的药物代谢分布和更长的血液循环周期，更易渗透进入实体肿瘤组织[6]。
采用scFv作靶标修饰脂质体携带药物进入肿瘤细胞有着巨大的潜力，它与较大的外源性片段相联时能降低免疫原性，在提取和纯化方面的研究工作也在深入开展【7】。
Shmeeda等『81将抗HER2的scFv修饰脂质体，分别制成大约每个脂质体结合有 7．5、l5、30个scFv，小鼠体内试验中，scFv一脂质体和HER2表达的细胞的结合率是普通脂质体的2O倍，且结合有15个配体的脂质体最优。
Cheng和Allen[9】比较了应用抗CDI9的整个单抗、Fab’片段、单链Fv结合的免疫脂质体包裹阿霉素，靶向B细胞CD19抗原，研究发现Fab’结合的免疫脂质体具有最长的循环半衰期。
1．2 受体介导的免疫脂质体利用受体与配体结合的专一性，针对体内某些组织和器官中存在的特殊受体能选择性识别配体，将脂质体与配体共价结合，此类脂质体被称为受体介导的免疫脂质体。
许多肿瘤细胞表面有些特殊受体过度表达，比如叶酸受体、转铁蛋白受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体、人表皮生长因子受体和一些细胞粘附分子等【．o】，因此可以利用此类受体介导的细胞内摄作用将脂质体运送到癌细胞中。
叶酸修饰的脂质体粒径大小对受体介导的内摄作用有重要影响，脂质体粒径小于60nm时更易被脑肿瘤细胞摄取【l11，因此将脂质体制成纳米粒作为运送药物的载体【】。
许多肿瘤细胞的表面和脑微血管内皮细胞表面都富含转铁蛋白受体(TFR)，因此，经抗TFR单抗或转铁蛋白介导的脂质体可将药物靶向至肿瘤细胞和脑组织。
血管内皮生长因子受体是一个非常重要的血管生成调节物，为跨膜受体，和血管瘤的发生发展有非常密切的关系，VEGF只有通过与血管内皮细胞上的受体结合才能发挥其生物学作用。
在血管瘤中VEGF受体高度表达，血管瘤内皮细胞过度增殖和VEGF 密切相关。
表皮生长因子是酪氨酸激酶受体，其家族有4个受体和跨膜转运密切相关，分别是HER1fepidermal growth factor receptor，EGFR)、HER2、HER3和HER4。
HER2在许多实体瘤中高表达，如子宫人膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌等。
曲妥珠单抗(trastuzumab)tl31是第一个获FDA批准用于HER．2阳性乳腺癌治疗的重组人源化单抗，可直接作用于HER一2的胞外域蛋白(ECD)，封闭HER．2受体，从而引起肿瘤消退，与脂质体结合后包裹毒素蛋白可用于治疗多种肿瘤。
免疫毒素如PE38KDEL因为非特异的毒性在临床应用上受到了很大限制，有报道用脂质体装载并结合抗一HER2的Fab’制得粒径小于200nm的免疫脂质体，因HER2受体介导的细胞内摄作用，药物浓度在肿瘤细胞内较高【l4】。
2 抗体连接脂质体的方法抗体由两条轻链和两条重链组成，每对链由链内二硫键键合，大多数脂质体偶联的抗体一般是重链的IgG构型。
在IgG构型中，用于抗体一脂质体连接的功能基团通常为氨基(一NH．)、二硫键(．s—s一)、糖基等。
抗体可直接连接在脂质体表面，也可连接在修饰脂质体的PEG末端，而后者被证明所需抗体量较少(每个脂质体的PEG末端可连接l0—20个单抗分子)，更容易到达靶位【"】。
脂质体与单抗的表面结合方法有多种，其中化学偶联法最为常用。
目前主要采用十一醛、戊二醛、碳二亚胺、琥珀酰胺盐、琥珀酰亚胺乙酰硫代乙酸~(SATA)、N一琥珀酰一3一(2一联硫基吡啶)一丙酸盐(N．Succinimidyl一3一(2一yridyldithio))propionate，SPDP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、聚乙二醇末端带吡啶二硫丙酰苦磷脂衍生物(PDP—PEG．HSPE)等进行偶联fl6]。
Feng 7]用蛋白A抗体的亲和序YlJ~HGaussia荧光酶(Gaussia luciferase，GLase)相连并结合抗表皮生长因子单抗(GLase—ZZ —His—mAb)，DSPE．PEG—MAL作为偶联剂，制备成双功能脂质体。
其中连接有荧光酶的单抗也作为检测成像的组份，这种检测方法比其它荧光成像法在肿瘤区域表达的信号更强烈，也为脂质体的检测提供了一种新的方法。
叶果等[18】用25％的戊二醛偶联MRK．16于阿毒素脂质体，制备的MRK．16修饰的免疫脂质体对非小细胞肺癌多药耐药具有一定的逆转作用。
以上方法中，脂质体和MAbs的共价结合可能会使mAbs失去活性或~I]mAbs上的随机位点结合。
脂质体~1]mAbs的非共价结合的方法包括利用生物素一亲和素【 ]、镍一蛋白【 o_2l】、叶酸一叶酸结合蛋白【zz]之问的亲和力进行结合。
但是生物素有4个结合位点，在进行结合反应时可能造成生物素酰化的脂质体交联而导致脂质体聚集；镍由于潜在的毒性和体内稳定性差而存在安全隐患问题；叶酸结合蛋白和叶酸通过硫醚键结合，它只有单个结合位点并且是内源性蛋白，产生免疫原性反应的可能性较低。
当脂质体被细胞内吞后，在低PH环境中，叶酸和叶酸结合蛋白问的亲和力下降，脂质体和抗体解偶联，这也许有利于脂质体内的药物在亚细胞内的释放。
3 免疫脂质体的应用3．1 作为肿瘤治疗药物的载体3．1．1 作为化疗药物的载体化疗是肿瘤治疗的手段之一，但化疗药物在杀死或抑制肿瘤细胞的同时，对正常组织的毒副作用也较大。
以免疫脂质体作为此类药物的载体，可以改变其传递和释放方式，提高疗效，减少毒副作用。
化疗常用的药物有紫杉醇、白喉毒素(D81、长春新碱、氨甲蝶呤、柔红霉素、放线菌素3 D、丝裂霉素、顺铂、阿糖胞苷等，使用的毒素有蓖麻毒素及其A链等，均可用免疫脂质体作载体运输到肿瘤细胞。
Yang等[ ]用后插入法(post—insertion)~lJ备载有紫杉醇的PEG修饰的免疫脂质体，由于受体介导的细胞内摄作用，发挥很好的靶向作用，在临床上可用于治疗乳腺癌。
当免疫脂质体用萤光显色后，在共聚焦显微镜下发现其能进入HER2过度表达的细胞内，特别是在37 0C时效果更为明显，而在HER2表达低的细胞中或是低温时比~t1]4℃时，和普通的脂质体没有明显的区别。
考布他汀(combretastatin)[24]是一种抗血管药物，它能抑制肿瘤组织的血流量，使肿瘤细胞缺氧，降低肿瘤区域的物质代谢，但同时对心、脑、脾、皮肤、。
肾等正常组织的血流量也有很大影响。
当考布他汀这类血管抑制剂和放射疗法结合后，能表现出最大的抗肿瘤效果。
因为放射治疗能增量调节(upregulate)辐射区域的一些粘附分子Lh~HE—selectin，包裹于连接anti—E—selectin的免疫脂质体就能更多地聚集到肿瘤区域。
实验证明分次放射治疗结合分次给予考布他汀免疫脂质体的方案比其它治疗方案能更显著地抑制肿瘤生长。
盐多柔比星脂质(doxil)注射液【zs】于2007年获FDA批准用于多发性骨髓瘤的治疗，但会引起耳内红斑(auricularerythema，AE)这种皮肤粘膜反应，在其表面结合抗癌2C5单抗(mAb2C5)，制成免疫脂质体后，药物在正常皮肤的的浓度急剧下降，引发AE的机率降低了3～4倍。
3．1．2 作为放射性核素的载体放射免疫治疗是用特异性的单抗与放射性核素交联形成偶联物，引入人体后能特异性杀伤肿瘤细胞，对正常组织影响较小。
硼中子俘获治疗(boronneuron capture therapy，BNCT)是一种治疗肿瘤的放射化学方法，已经临床应用于恶性神经胶质瘤、黑色素瘤、脑肿瘤、头颈癌以及肝癌的治疗[26】。