耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序1.项目概述耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素（如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等）或基因和环境两者共同作用而致。
在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿，50% 患儿的耳聋与遗传因素有关。
70%的遗传性耳聋不伴有其他症状，称为非综合征性耳聋 ( nonsyndromic hearing impairment, NSHI)。
非综合征耳聋是最常见的感音神经性聋，可以分为常染色体显性（DFNA，15％~ 20%）、常染色体隐性（DFNB，80%）、性连锁（DFN X-linked，1%）和线粒体遗传性耳聋（1%）四类。
迄今为止，共有114个耳聋位点见诸报道（54个为常染色体显性位点，60个为常染色体隐性位点）。
40余个感音神经性耳聋基因和更多的综合征耳聋基因被克隆。
据中国残疾人联合会网站统计，中国6000万残疾人口中2100万为听力残疾者。
听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增3万聋儿的速度在增长。
研究表明，大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者也是由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。
因此，需要开展耳聋基因检测，对于由明确检测到的基因缺陷致病的患者及早进行干预治疗与预防措施，提高患者的生活质量，降低患耳聋的风险度。
2.测定原理本试剂盒采用了PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。
采用生物素标记的引物分别对耳聋易感基因突变区域进行特异性扩增，将扩增产物与标记不同突变类型耳聋易感基因探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交，然后通过化学显色对结果进行判读。
3.样品采集和制备3.1. 标本采集：①成人男性和女性及患儿：采用无菌抗凝管(添加抗凝剂)，抽取静脉血2ml耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序生效日期：混匀，拧紧瓶盖并标上病人编号。
②滤纸血斑采集卡：婴儿采血方法A.6周~4月或小于5kg的婴儿采用脚后跟采血法；B.4~10月或5~10kg的婴儿采用脚大拇指采血；C.大于10月或大于10kg的婴儿采用手指采血。
标本采集时，尽量让采集血液将圆圈浸满，以便试验有足够的标本量。
图1 采血部位图2 采血流程静脉采血后滤纸：用柠檬酸钠或EDTA抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取75~80ul全血，对准采样圈中心缓慢将血液滴加在滤纸上，避免气泡产生；至少采集3个血圈。
酒精消毒，用无菌纱布垫擦干针刺，无菌纱布垫擦去第一滴血用滤纸蘸取单个血滴，让血滴充分浸润采血圈；至少采集3个采血圈温浴采血部位：不超过41℃，3~5分钟耳聋易感基因检测试剂盒实验标准操作程序生效日期：3.2.滤纸血斑处理血样采集完毕后，将制成的滤纸干血斑采集卡在干燥、清洁、平整、无吸水性的桌面放置3~4小时风干；或将采集卡放置于专业纸质干燥架上自然风干。
不要放在太阳下晾晒或用任何人工方法（如烘干机）加速干燥。
3.3.滤纸干血斑的质量控制及有效性的判断合格血斑的六条标准是①每个血斑直径要达到10mm；②同时取3个以上血斑；③血液必须完全渗透到滤纸背面；④无重叠；⑤无污染；⑥易洗脱。
采集好的血斑标本应按要求保存，避免因保存不当造成标本固化于滤纸上，检测时被测物洗脱不下或部分洗脱，出现假阴性结果。
图3 有效样品图4 无效样品样本量不足样本未干血液粘连过度血斑褪色、污染出现血清环血斑分层3.4. 标本保存3.4.1抗凝全血样本a)短期保存：抗凝血在2-8℃存放7天以内，不影响DNA提取效果。
当需要得到完整全长的基因组DNA时，抗凝血在2-8℃的保存不应超过3天。
当抗凝血在4℃存放至两个月时，虽可提取DNA，但得率会相应下降。
b)长期保存：抗凝血在低温保存时（-20℃或-80℃），其保存时间可至两年以上而不影响纯化出高质量的DNA，但要避免反复冻融。
3.4.2滤纸干血斑样本样品风干后，将每张滤纸片采集卡分装入封口袋中，最好在封口袋中同时放入干燥剂和保湿卡，轻轻将封口袋的空气挤压出去再封口，遵循一袋一卡的原则，以避免交叉污染。
血片采集后，避光、防潮保存；常温干燥最多可保存3周， 2℃~8℃可保存一个月， -20℃可保存三个月。
3.5. 标本的运送1）滤纸干血斑的递送准确填写样本信息卡后，将采集卡和信息卡一同放入大信封，邮寄前再次核对送检单与样品是否相符。
采用常温运输。
2）静脉血递送从无菌抗凝管(添加抗凝剂，混匀）中吸取500ul外周血到EP管中，密封并标上病人编号等信息后，放置到具有匹配尺寸的标本架中，盖好盖子，用透明胶布黏好，同时附上打印好的患者信息（袋子装好），放置在具有冰袋的泡沫箱中，采用低温运输。
3.6拒收样本：不合格的样本3.7不合格样本经审核退单处理的，如果委托方坚持要求检测，需签风险单。
4.仪器高速离心机、PCR基因扩增仪、凯普导流杂交仪HB2012A等。
5.试剂5.1厂家：凯普生物。
5.2稳定性：PCR试剂盒须置-20℃保存，杂交试剂盒须置2-8℃保存，提取试剂盒常温保存。
6.测定参数凯普的耳聋基因检测试剂盒采用凯普独特的专利技术——导流杂交技术，结合低密度芯片技术检测遗传性耳聋患者所涉及的4个相关基因（GJB2, GJB3, SLC26A4和12S rRNA）的主要突变位点，在一张芯片上同时检测13种突变位点，检测类型如下表所示。
7.校准7.1 本试剂无校准品，不适用。
7.2 定期仪器的校准，请参考相关仪器的校准标准操作规程。
8.操作步骤8.1试剂的准备（试剂贮存和准备区）8.1.1进入缓冲区,换上该区的蓝色工作服和工作鞋,带上口罩、帽子和手套。
8.1.2从试剂盒中取出所需试剂盒，放置室温溶解后轻甩将管壁试剂甩到底部。
8.1.3 向AB管PCR混合液中各自加入15ulDNA聚合酶。
振荡混均，再点动离心。
8.1.4 准备60个0.2PCR单管，A管，B管PCR混合液各自按28ul的体系分装30人份。
盖上盖子，做好相应标识。
8.1.5 取出当天要使用的分装好的PCR混合液，如果有当天使用不完的，请放置于 -20冰箱保存，下次可以直接取出使用。
请不要反复融。
8.2样本处理（标本制备区）8.2.1血液样本提取①进入缓冲区，换上该区的黄色工作服和工作鞋，带上口罩、帽子和手套。
②将抗凝血液标本解冻编号，振荡混匀。
③吸取200ul血液样本，若血液样本不足200ul时，用溶液P补足体积至200ul。
④加入20ul蛋白酶K，混匀。
⑤加入200ul溶液L，振荡混匀，56℃温浴15-20min，期间颠倒混匀数次。
⑥加入200ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑦在硅胶柱中加入500ul溶液W1（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑧在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑨在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
⑩将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，丢弃收集管。
将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置1-2min，往硅胶柱中心加入60-200ul的TE洗脱液（50-60℃预热），静置5min，12000rpm离心2min，丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。
（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul，体积过小影响回收率。
为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。
获得的DNA应保存在-20℃，以防DNA降解。
）8.2.2血斑样本提取①进入缓冲区，换上该区的黄色工作服和工作鞋，带上口罩、帽子和手套。
②用打孔器将采集卡样本上的两个血斑卡剪下来，置于1.5ml离心管中（注意：使用打孔器处理样本需注意避免交叉污染）③加入300ul的溶液T（若血斑量较多时，相应增加适当量的溶液T，溶液T没过血斑），再加入20ul蛋白酶K，混匀。
④56℃温浴25min，期间颠倒混匀数次。
56℃温浴温浴后，点动离心，往上述EP 管中加入200ul的溶液L，震荡混匀，70℃温浴20min，把裂解后的液体转移到一个新的EP管中。
⑤加入200ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑥在硅胶柱中加入500ul溶液W1（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑦在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。
⑧在硅胶柱中加入500ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
⑨将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，丢弃收集管。
将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置1-2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE 洗脱液（50-60℃预热），静置5min，12000rpm离心2min，丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。
（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul，体积过小影响回收率。
为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。
获得的DNA应保存在-20℃，以防DNA降解。
）8.2.3点样取出反应管做好号码标记，AB两组反应管中，每个反应管分别加入样本模板2ul，密封后瞬时离心数秒。
把离心好的反应管放入传递窗内。
做好记录及清洁和消毒工作；换下工作服、工作鞋，口罩，帽子，并处理生物垃圾。
8.3PCR扩增8.3.1进入缓冲区,换上该区的粉红色工作服和工作鞋,带上口罩、帽子和手套。
8.3.2取出PCR反应管，依次放入PCR仪中，选择已经设定好的程序开始扩增。
8.3.3做好记录及清洁和消毒工作；换下工作服、工作鞋，口罩，帽子，并处理生物垃圾。
8.4 杂交8.4.1进入缓冲区,换上该区的紫色工作服和工作鞋,带上口罩、帽子和手套。
8.4.2试验前准备8.4.2.1打开水浴锅，将温度调至45℃。
8.4.2.2从冰箱中取出杂交试剂盒，将所有杂交检测试剂放置在室温下,使其温度平衡到室温。
8.4.2.3 将杂交液、WB1试剂瓶放入45 C水浴锅中预热。
8.4.3 HB2012-A型医用核酸分子快速杂交仪准备8.4.3.1 打开HB2012-A型医用核酸分子杂交仪电源。