Am
lacZ
N2H
COOH
片段
片段
目录
Lac Z
X-gal 蓝色化合物
X-gal
目录
α 互 补 的 检 测
目录
（LacZ基因 N端序列） LacZ基因 C端序列
插入片段 （LacZ基因失活）
LacZ酶
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（二）酶切鉴定
DNA Marker
加 样 孔
空质粒 重组质粒
重组质粒酶切 重组质粒的PCR 扩增片段
大肠杆菌（ E.coli）受体细胞
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1 E.coli表达体系
优势：
一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制
易于进行遗传操作和高效表达
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不足之处：
1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。
2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特 异性空间结构。 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。
凝胶电泳检测
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（三） DNA序列检测
A C T G A A G G C T
目录
（四） 菌落杂交筛选法
原位杂交
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（五）免疫化学检测法
滤膜（固定抗体）
+
放射性抗体检测法
目录
分
目的基因 基因载体
切
接
重组体
总 体 技 术 路 线
转
筛
表
目录
表
外源基因在宿主细胞中的表达
重组子 目的基因 的mRNA 表达蛋白质
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
目录
（一）限制性核酸内切酶
1 核酸酶的分类
2 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
pUC系列
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（3）病毒载体 （4）粘性质粒
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2 载体的条件

有扩增所需的复制起始点，即能自主复制； 有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的 筛选和鉴定； 表达型载体必须具有指导基因表达的调控元 件。


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多克隆位点
polylinker
的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我
复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA (recombinant DNA) 。
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生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
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分
三 目的基因及载体的分离
（一）目的基因的获取
直接从染色体DNAR 直接索取
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（二） 基因载体
定义 能携带目的基因进入宿主细胞并且在 宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分 子。 1 载体的种类
质粒DNA
噬菌体DNA
①
能
Klenow片段
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
①
反转录酶
多聚核苷酸激酶
末端转移酶 碱性磷酸酶
细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
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切四 限制性内切酶剪切目的基因与载体
酶切
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同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
目录


（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ （三）T4噬菌体DNA聚合酶 （四）TaqDNA聚合酶 （五）反转录酶 （六）连接酶 （七）末端（脱氧核苷酸）转移酶 （八）碱性磷酸酶
目录
连接方式
相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接
目录
CCGG GGCC
CCGG GGCC
CGG C
C GGC
CCGG GGCC
HapⅡ
T4-DNA 连接酶
CGG C C GGC
粘端连接
目录
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AGCT TCGA
AluⅠ
DNA连接酶
目录
2目的基因在E.coli中的高效表达 三个因素：
强化蛋白质的生物合成
抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象
目录
3目的基因表达产物的检测
1）蛋白质的PAGE
对照 样品 Marker
目录
2）表达蛋白生物学功能检测
淀粉酶基因表达
目录
3目的蛋白的分离纯化
分子筛
亲和柱
离子交换
抗原抗体
目的蛋白
目录
DNA克隆
颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子
促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 生长素 胰岛素 干扰素( 1b, 2a, 2b, ) 白细胞介素 超氧化物歧化酶
剌激白细胞生成
剌激白细胞生成 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病 抗病毒感染及某些肿瘤 激活、剌激各类白细胞 抗组织损伤 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗 预防乙肝 预防霍乱
DNA克隆技术
许丽辉
目录
一、概述
（一）基本概念 1 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 2 动物克隆 3 杂交
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克隆羊：
个体水平
细胞克隆：
DNA克隆：
细胞水平
分子水平
目录
Ａ母绵羊
Ｂ母绵羊 细胞拆合技术 乳腺细胞
重组体转 入细菌
CaCl2处理
目录
Am
JM109感受态
重组 质粒
感受态
含氨苄平板
目录
转化后的克隆群体：
目录
筛 七、重组体克隆的筛选与鉴定
连接
目的基因
转化
基因载体
连接酶
宿主细胞
含氨苄平板
目录
（一）初筛：遗传检测法
1）抗药性标志的选择
Amp Tet 插入片段
pBR322
Tet平板
Amp平板
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2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）
病毒DNA
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（1）质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
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（2）噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列
平端连接
目录
目的基因
载体
限制性内切酶 限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
目录
转
六、重组体的转化
受体细胞
目录
转化方法
CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装
受体细胞
特殊处理
细胞膜特性 改变
目录
50-100mmol/L CaCl2
受体细菌
感受态 细菌
不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
卵细胞
细胞质 细胞核移植
细胞核 融合后的卵细胞 卵裂
早期胚胎
胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
目录
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
连接形成重组DNA 分子。
质粒DNA
4 重组：不同的DNA分子间发生共价
基因片段
重组DNA
目录
目录
5 DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传
物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
目录
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意 设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
目录
其他载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)
目录
单克隆抗体
乙肝疫苗(CHO, 酵母) 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗
（三）重组DNA技术技术路线
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌
外源基因与载体的连接
重组体的筛选
克隆基因的表达
目录
二、重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 功 识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端