E Escherichia co coli R RY13 I 首先发现
(属) (种) (品系) 在此类细菌中发现的顺序
DNA连接酶
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大 肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助 ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA 链的3’-OH生成磷酸二酯键将两条紧邻DNA链连接起来。
mRNA 5’ 单链cDNA 3’
5’ 3’
RT反应
AAAAAAAAAAAAAAAAA 3’ 3’ TTTTTTTTTTTT 5’
TTTTTTTTTTTT 5’
PCR扩增 3’ 5’
转录起始调控区（启动子区）的扩增
转录起始点
转录起始调控区 基因（DNA）
外显子 内含子
PCR扩增
5’ 3’
3’ 5’
课时及内容安 排
第一课时: 基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项 第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体
是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或 DNA片段的克隆。
OH
G CTTGG
PO4
AATTC A
连接酶
GAATTC CTTGGA
CTG
ATT
GAC
TAA
连接酶
CTGATT GACTAA
内切酶和连接酶是基因克隆实验中两种 重要的工具酶，它们如同分子生物学家剪刀 和针线，可以任意地将感兴趣的基因片段进 行切割和连接，实现DNA序列的重组。
质粒(plasmid)和载体(vector)有什么区别？
生物的性状。
染色体、DNA 与基因之间的关系
基因的结构及其表达蛋白的过程
转录起始点 外显子 内含子
转录起始调控区 基因（DNA）
5’ 非翻译区
转录
转录终止点 转录终止信号
3’ 非翻译区
初级转录本（hnRNA）
RT-PCR 双链cDNA
加帽 成熟mRNA
蛋白质
加工 翻译
加poly（A）
RT-PCR扩增基因的编码区序列
非定向克隆
+
或
TA克隆载体
T T
A
A
酶切位点定向克隆的克隆载体
P(BLA) ApaLI (2367)
AP r
pUC19
2686 bp
ApaLI (178) ALPHA EcoRI (397) AvaI (413) XmaI (413) SmaI (415) BamHI (418) PstI (440) HindIII (448) P(LAC) ORI
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子； （3）质粒对宿主生存并不是必需的； （4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:是从细菌中分离 出来的一种识别并切割特异的双链DNA序列的内切核酸酶。 目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷 酸顺序。
2. 学术文献上： (1) 基因克隆是指在体外对DNA按照即定目的和方案进行人工重组,将重
组DNA进行扩增以获得目的基因的大量拷贝。 (2) 它是将DNA或基因组的DNA片段嵌入克隆载体，再将载体植入培养
的宿主细胞。 (3) 科学家将这一过程称为基因克隆：基因表达需有调节的DNA片断控
制，要使克隆到的基因能表达、发挥作用，必须将其与调节单位连接 起来。
质粒是指细菌细胞质中的小型环状DNA分子，是 天然存在的，主要控制细菌的次级代谢。
载体是指在基因工程中用以协载目的基因的小型 环状DNA分子，载体一般是经过改造的质粒，还 包括病毒，部分高等生物细胞中的DNA。
载体的种类
克隆载体：一般是只用来在大肠杆菌中扩增基因序列的拷 贝数。
表达载体：除了能扩增基因序列的拷贝数之外，还能在原 核或真核细胞中表达目的蛋白，也可用鉴定基因表达调控 元件的功能。根据表达目的蛋白所使用启动子不同分为原 核表达载体（原核启动子）和真核表达载体（真核启动 子）。
ApaLI (1121)
非定向克隆
+
克隆的片段只能按特定方向连接
P(BLA) ApaLI (2367)
AP r
pUC19
2686 bp
ApaLI (178) ALPHA EcoRI (397) AvaI (413) XmaI (413) SmaI (415) BamHI (418) PstI (440) HindIII (448) P(LAC) ORI
什么是Байду номын сангаас因？
1、基因是存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位。 2、基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。 3、编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因。 4、基因是生物体遗传的基本单位，存在于细胞的染色体上，
作直线排列。 5、基因通过指导蛋白质的合成来传递遗传信息，从而控制
ApaLI (1121)
EcoR I+Hind III切
EcoR I
Hind III
EcoR I Hind III PCR扩增
EcoR I
A
Hind III
A
EcoR I+Hind III切
启动子区序列
转录终止点 转录终止信号
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
GAATTC CTTGGA
EcoR I
G
AATTC
CTTGG
A
AAGCTT TTCGAA
Hind III
A
AGCTT
TTCGA
A
限制性核酸内切酶的命名法则
限制性核酸内切酶的命名：一般是以微生物属名的第一个 字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。 例如：EcoR I是从大肠杆菌Escherichia coli RY13 中第一个发 现的内切酶I 。