转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
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4
基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是 应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操 作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形 成大量的子代DNA分子的过程。
目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）
复制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点
在目的基因合适的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位点
整理课件
9
ori 是复制起点,他被宿主细胞识 别后才能在该细胞中复制。
整理课件
10
整理课件
11
引物设计
pCR
回收纯化
381bp 381bp 381bp
744bp 744bp 744bp
450bp 450bp 450bp
2700bp
1485bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
整成成理功功 课件
目的基因 NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS4A+2K-1 NS4A+2K-2 NS4A+2K-3
NS5-3
E
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
长度 1854bp 1854bp 1854bp
The principle and experiment of gene cloning
整理课件
1
实验进展汇报（5.10~8.24） 基因克隆基本原理及实验操作
整理课件
2
目的基因 NS1-1 NS1-2 NS1-3
NS2A-1
NS2B-1 NS2B-2 NS2B-3
NS3-1 NS3-2 NS3-3
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
备注 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变
中间有2个位点突变
不配对 双峰 中间有1个位点突变
测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通
需要重新设计引物，直接pcr
需要重新设计引物，直接pcr
需要重新设计引物，直接pcr
需要重新设计引物，重新实验
需要重新设计引物，重新实验
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
与克隆载体 连接
感受态 E.coli制备
转化、培养
测序
PCR或 酶切鉴定
整理课件
质粒提取
重组克隆 筛选
8
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编 号
保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）
需要重新设计引物，重新实验
PCR做不出来 PCR做不出来 PCR做不出来
中间有4个位点突变
前后有数个位点突变 前后有数个位点突变 前后有数个位点突变
中间有3个位点突变 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变
结果 成功 成功 成功 成功 失败 失败 成功
成功 成功 成功
失败 失败 失败
失败 失败 失败 成功 成功 成功 成功 成功
整理课件
5
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
整理课件
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
6
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
整理课件
载体 目的片段
7
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增产物 纯化
859bp
859bp
859bp
336bp
336bp
336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
NS4A-1
NS4A-2
NS4A-3
NS4B-1
NS4B-2
NS4B-3
NS5-1 NS5-2rM-1 prM-2 prM-3
长度 1056bp 1056bp 1056bp
654bp
390bp 390bp 390bp
1854bp 1854bp 1854bp
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
备注
有2个突变 有2个突变 有2个突变
没有突变 没有突变 没有突变
有2个突变 有3个突变 有2个突变
结果
成功 成功 成功
成功 成功 成功
失败 失败 失败
PCR做不出来
失败
无信号，取消测序
没有突变 没有突变
失败
成功 成功
3
分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其 规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子， 其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传 递中的作用和作用规律。
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
整理课件
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag