生化与分子生物学实验指导-（)————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:ﻩ实验一 氨基酸纸层析法一、实验目的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。

二、实验原理纸层析法(ｐａp ｅｒ c ｈro ｍａt ｏgr ａphy ）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。

纸层析法又称纸色谱法,是用滤纸为支持物,所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成,滤纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相,有机溶剂是流动相。

溶剂由下向上移动的,称上行法；由上向下移动的,称下行法。

将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。

由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用Rf 值表示：在一定条件下某种物质的Ｒf 值是常数。

Ｒf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。

只要条件(如温度、展层溶剂的组成）不变,Rf 值是常数,故可根据Ｒf 值作定性判断。

样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的R ｆ值相同或相近,此时如只用一种溶剂展层,就不能将它们分开。

为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度,再用另一溶剂展层,从而达到分离目的,这种方法称为双向纸层析法。

氨基酸无色,可利用茚三酮显色反应,将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生(亮)黄色物质。

三、药品器材1器材层析滤纸（新华1号)、喷雾器、剪刀、层析缸、毛细管、电吹风、刻度尺、铅笔。

R ｆ=原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离2试剂(1)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液(各组分浓度0．5％)。

(2)展层剂：V[正丁醇（A．R.)］:Ｖ(80%甲酸):V（水）=15:3:2(3)显色剂:0．5g茚三酮溶于１00ｍＬ无水丙酮,贮存于棕色瓶中备用。

四、实验方法1.滤纸准备:选用新华1号滤纸，裁成5cm×2０cｍ的长方形,在距纸一端２cm处用铅笔轻轻划一基线,在线上每隔１cm作一记号，标出4个原点。

2.点样：用毛细管将氨基酸样品分别点于原点（用量10~20uＬ），用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复2～3次,点子直径不能超过３mｍ。

3.展层:将点好样的滤纸放入装有展层剂的展层缸内盖展层缸进行展层，展层剂液面不能淹没原点基线,当溶剂上升至１5~20cm时,取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿线,把滤纸烘干。

4.显色:用喷雾器在滤纸上均匀喷上显色剂，用热风吹干，层析斑点即可显现。

5.结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状,并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离,计算各色斑的Rf 值，与标准氨基酸的Ｒf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。

五、实验结果及分析六、思考题影响氨基酸Ｒf值的因素有哪些?实验二甲醛滴定法测定氨基氮一、实验目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。

二、实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：ﻩ－NＨ3是弱酸,完全解离时PH为１１-12或更高,若用碱滴定－NH3所释放的Ｈ＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10,很难准确指示滴定终点。

常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合,生成羟甲基化合物,使上述平衡右移,促使－NＨ3释放H+，使溶液的酸度增加,滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH９．0左右）。

因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

如样品为一种已知的氨基酸,从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。

如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液,则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。

但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度,随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时,表明水解作用已完全。

三、器材及试剂1.实验器材25ml锥形瓶;3mｌ微量滴定管;吸管；研钵。

2．实验试剂(１)3０0ml 0.05moｌ/Ｌ标准甘氨酸溶液准确称取３75mg 甘氨酸,溶解后定容至100ｍl。

（2)５00ml 0．02mｏl/L标准氢氧化钠溶液(3)20mｌ酚酞指示剂0.5％酚酞的5０％乙醇溶液。

(４）400ml中性甲醛溶液在50ｍl３6－３７％分析纯甲醛溶液中加入１mｌ０.5%酚酞乙醇水溶液，用0.02mol/L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

四、实验方法1、取３个２5 ml的锥形瓶，编号。

向１、2号瓶内各加入0.０5mol/L标准甘氨酸溶液2mｌ和水5ml，混匀。

向３号瓶内加入7 ml水。

然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂,混匀后各加2 ｍｌ甲醛溶液再混匀，分别用0．0２mｏｌ/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。

重复以上实验两次,记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。

取平均值,计算甘氨酸氨基氮的回收率。

2、取未知浓度的甘氨酸溶液2ml,依上述方法进行测定,平行做几份,取平均值。

计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。

五、结果处理1.回收率计算：甘氨酸氨基氮回收率%= 实际测得量×100 加入理论量公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度,再乘以14.008。

2.氨基氮计算:氨基氮（毫克/毫升)= （V未－V对）×ＮNａOH×14．0082公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。

Ｖ对为滴定对照液(3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。

NＮａOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。

六、思考题为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—NH3+基上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？实验三蒽酮比色定糖法一．实验目的:１．学习分光光度法的基本原理2．学习对蔬菜和食品中糖含量进行测定的方法二．实验原理1．分光光度法基本原理:溶液中的物质在光的照射激发下,产生对光的吸收效应，不同的物质具有各自选择性的吸收光谱，因此，当某单色光通过溶液时，能量会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质浓度有一定比例关系，即符合于比色原理——比尔定律。

2.朗伯-比尔定律Ａ＝ｌｇ(1/T）=ＫbcA：为吸光度,T:为透射比,是透射光强度比上入射光强度c:为吸光物质的浓度b：为吸收层厚度K：比例常数３．物理意义当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,起其吸光度A与吸光物质的浓度ｃ及吸收层厚度ｂ成正比。

4.蒽酮比色法蒽铜比色法是一个快速而简便的定糖方法。

蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸反应，反应后溶液呈蓝绿色,在6２0nm处有最大吸收。

蒽酮可与其他一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。

当样品中存有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。

对于特定的糖类，反应较稳定。

本法多用于测定糖原含量,亦可用于测定葡萄糖含量。

三.实验试剂（1)蒽酮试剂:取0.２ｇ蒽酮溶于100ｍL 8０%(V/V）硫酸中,当日配制使用;(２)标准葡萄糖溶液(0.1mg/ｍL)：(可滴加几滴甲苯作防腐剂);（3）糖样品溶液。

四.实验步骤1．制作标准曲线:取干试管6支，依次加入标准糖溶液0，0．2，０.4,0．6，０.8,１．0 ml,并依次用蒸馏水补足体积到1mL,各管均加入蒽酮试剂4mＬ,沸水浴准确煮沸10min，室温放置10mｉn,用1号试管溶液调零，比色测定A620。

用标准糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标,制作标准曲线。

管号ﻫ1＃2＃3#4#5#6#７#标准葡萄糖溶液(ml)０0.20.４0.60.8１．0蒸馏水(ml)１．00.８０.60.４0.20样品液／///／／ 1.02.样品含糖量测定:无蛋白糖溶液样品溶液稀释100倍，吸取1mL 置试管中，再加入４mL 蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量（ｍg/ml ）。

五、实验结果1.制作标准曲线2.计算样品中糖浓度六、思考题H ２S Ｏ4在实验中起什么作用？酪蛋白的制备一、实验目的1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。

2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。

二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为３5g ／Ｌ。

酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电(ml)置冰水浴中冷却5ｍin蒽酮试剂(m ｌ)4.０４．04.04.０4．0４.０4.0沸水浴中准确加热10min,取出,用自来水冷却，室温放置１0min A620nm糖溶液浓度(mg/ｍｌ)0 ０．０2 0.04 0．06 ０.08 0.１0 待测点为4．7。

利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。

用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、材料、试剂与仪器１. 材料新鲜牛奶2.试剂（1）．95％乙醇1200ｍL（2）无水乙醚１200ｍＬ（3）0．2mol/L pH4．７醋酸—醋酸钠缓冲液300ｍl先配A液与B液Ａ液:0．2mol／L醋酸钠溶液称NaＡC·3H2O ５4.44g，定容至2０00ml。

B液：0.2mｏl/L醋酸溶液,称优纯醋酸(含量大于９9.8％）12.0g定容至1０00mｌ。

取Ａ液1770mｌ,Ｂ液１230mｌ混合即得Ｐh4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。

（4）乙醇—乙醚混合液乙醇：乙醚=1 ：１(V/Ｖ)3.仪器离心机、抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、温度计四、操作步骤1.酪蛋白的粗提100ｍL牛奶加热至40℃。

在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4．７的醋酸缓冲液100mL．用精密ｐH试纸或酸度计调ｐH至４．7。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心1５分钟（3000 r/min）。

弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2.酪蛋白的纯化（1）用水洗涤沉淀3次，离心10分钟(3000r/ｍin)，弃去上清液。

（2）在沉淀中加入30mＬ乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。

最后用乙醚洗沉淀２次，抽干。

（3）将沉淀摊开在表面上，风干;得酪蛋白纯品。

3.准确称重,计算含量和得率。

含量：酪蛋白ｇ/100 mＬ牛乳(ｇ%)式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。

五、实验结果及分析六、思考题１、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2.熟练分光光度计的使用和操作方法。