RNA模板 2μl Oligo(dT)15
1.5μl
65 ℃,5min; 4 ℃,1min; DEPC处理水 14μl 5xRT buffer 5μl dNTP 1.5μl RT酶 1μl
2000rpm离心20sec后,42 ℃,60min逆转录；85 ℃，5min终 止反应；4 ℃，3min，防止二级结构形成。
Taq酶
2.5μl
质粒提取（碱裂解法）
• 原理： • EDTA和表面活性剂存在下，经碱处理溶菌，同时 pH 12.0~12.6的碱性环境使细菌线性大分子染色体 DNA氢键断裂，双链解开变性，而质粒DNA的超 螺旋共价闭合环状的双链并不完全分离，在恢复中 性pH并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA又呈 天然构型，而细菌染色体不能复性，相互交联形成 不溶性网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质 -SDS复合物等一起，通过离心沉淀而除去。再经酚、 氯仿抽提方法进一步纯化质粒DNA。
注意事项 • 洁净是最重要的。 • 离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。 • 涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上 带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保 存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气 晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。 • 预冷是必要的。
二、质粒转化、平板筛选 • 制备含含100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板 上 （50 ℃ 时加入Amp ）
• 取感受态细菌100μl置于ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ菌EP管中；
• 加入重组质粒DNA10 μl，轻轻旋转混匀，冰上放置 30min，42 ℃热休克90sec（勿超时！），冰浴速冷12min。 • 加入无抗生素的LB培养基400μl，于37 ℃摇床（100150rpm）温和振摇45min，使细菌复苏并表达质粒的抗 性基因。 • 取100μl菌液均匀涂铺于含Amp的LB琼脂平板上 ， 37 ℃ 20min后，倒置平板继续培养10-16h(小于20h) • 挑取单菌落置5mlLB培养基中（含Amp） 37 ℃摇床培 养8-12h后，提取质粒，限制酶切鉴定。
一、感受态细菌的制备
1.取出液氮或低温冰箱中贮存的大肠杆菌在LB琼脂平板上划线,37 ℃过夜至长 出单菌落。 2. 挑选琼脂培养平板上的单菌落, 接种到含有3 m1 LB培养基的试管内，37℃振 摇过夜。次日取菌液1 m1接种至含有100 m1 LB培养基的500 m1烧瓶中， 37℃剧烈振摇（200~300 rpm）培养约2~3 h，待OD600值达到0.3~0.4时将烧瓶 取出立即置冰浴10~15 min。 自该步骤起皆需无菌操作。 3. 将细菌转移到一个预冷的1.5 ml灭菌的离心管中。于4℃离心，8000 g×1 min回收细胞。
RT-PCR扩增目的基因
第二步：PCR（总体积50μl） 灭菌双蒸水 31.5μl 10xTaq buffer 5μl Mg+2 4μl dNTP 1μl Sense primer 2μl Antisense primer 2μl
cDNA模板 2μl
2000rpm离心20sec后,94℃,1min；56 ℃，1min； 72℃， 1min ,30cycles; 72 ℃，10min 。
操作步骤
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(收集菌液于Ep管中，10000rpm×30 s，弃上清，用1 ml STE漂洗1~2次,离心弃上 清) 1．细菌沉淀加预冷的溶液I 100 μl重悬菌体，强烈振荡混匀。 2．加溶液Ⅱ 200μl，快速颠倒4~6次混匀内容物，冰上3~5 min（勿超时）。 3．加溶液Ⅲ 150 μl，反复颠倒数次混匀，冰上5 min 。 4．离心12 000 rpm×5 min，转上清至新Ep管中。 rpm 5.室温下加等体积饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。 6.离心14000 rpm ×5min，取上层水相到新Ep管中（5，6步可不做）。 7.加等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，离心14000 rpm ×5min，取上层 水相到另一管中。 8．加1/10体积的3 mol/L NaAc（pH5.2）和2.5 倍体积的无水乙醇，混匀，置-20℃ 10 min。 8．离心14000 rpm×10 min，弃上清。 9．沉淀用1 ml 70% 预冷的乙醇洗一次，离心12 000 rpm×5 min，弃上清。 10．将Ep管倒置于滤纸上吸净液体，室温下敞口蒸发痕量乙醇10~15 min 或真空 抽吸2 min。 11．加无菌双蒸水40 μl溶解沉淀。 12．加RNase A 1~2 μl（此步省略）, 混匀，置37℃水浴30 min后进行限制性内切 酶酶切实验（见实验六十七），或于-20℃保存待用；1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提
实验内容
•感受态细菌的制备 •质粒转化、平板筛选 •质粒的扩增、质粒提取（碱裂解法） •质粒DNA的限制性内切酶酶切及电泳鉴定
•真核细胞基因组DNA的分离纯化（蛋白酶K法） •DNA紫外定性、定量分析及电泳鉴定 •真核组织总RNA提取（TRIzol试剂法） •RNA紫外定性、定量分析及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 •RT-PCR扩增目的基因 mRNA的反转录 PCR及鉴定
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取质量
质粒DNA的限制性内切酶酶切
• 反应体系如下： 灭菌双蒸水 10×限制酶buffer 质粒DNA BamHІ HindШ 6μl 2μl 10μl 1μl 1μl
总体积20μl，混匀，37℃水浴1-3 h，，用1%琼脂糖凝胶 电泳鉴定结果。
RT-PCR扩增目的基因
第一步：RT（总体积25μl）
4. 弃去上清，将管倒置于滤纸上 1 min。
5. 加 1ml 4℃预冷的0.1 mol/LCaCl2重悬菌体，冰浴30分钟。 6. 4℃离心1 min, 回收菌体。弃去上清，将管倒置于滤纸上1 min。
7. 加 0.1 ml 4 ℃预冷的 0.1 mol/LCaCl2重悬菌体，置4 ℃冰箱过夜。
即可应用于转化。