E L L M试剂法测定自由巯基
和二硫键
Prepared on 22 November 2020
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)
5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-
根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L*10-
8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.
我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：
1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm
的吸收也不
3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对
SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在，其降解速度为%/h，在
5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12
时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].
试验方案
主要材料：
1.材料
PEG-G-CSF批号：080229浓度ml
G-CSF批号：080126浓度ml
10k超滤膜PALL
2.试剂
SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
20ug/小瓶。
加
入20ul50mMNH4HCO3，溶解，配成1ug/ul的酶液。
1MDTT刘春凤提供
TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114
乙腈：FisherScientificLot#055848
StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-
208241-001(includingα-Cyano-4-
hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibratio
nstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)
PEG肽段反相分离流动相
A液：%TFA/H2O
B液：%TFA/90%乙腈/H2O
3.仪器
质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号
KC2007-011)
Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039）
BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）
恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003）
反相柱：SymmetryC185um300à*150mm，LotNO
高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector）
试验过程：
一、缓冲液替换
PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为
50mMNH4HCO3，。
使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用
50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。
PEG-G-CSF的浓度约ml，G-CSF的浓度约ml。
二、酶切处理
1）取37ulG-CSF,共400ug，加入稀释为终浓度为2mg/ml。
取,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。
另做一空白对
照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离
G-CSFTrypsin+DTT反相分离
收样：
PEG-G-CSFTrypsin+DTT反相分离
四、ELLMAN试剂测定自由巯基
由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：
反应缓冲液：磷酸钠+，
温度：25℃
在这些参数下，摩尔吸收光系数为±*103LM-cm-[9].
1)标准曲线
用反应缓冲液配制10umDTT，20umDTT，40umDTT，80umDTT，
160umDTT，320umDTT。
用缓冲液配制10mM的ELLMAN试剂。
准
备两个比色皿。
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品
管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer),制作标准曲线。
2）样品巯基测定
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品
管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer)，根据标准曲线测定巯基。
参考文献：
1)产品说明书。
7)Riddles,—areexamination,。