ELLMAN试剂测定自由巯基
试验基于的原理：
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。

TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自
2-
吸光度
0.2来计算-*1cm）
1.4*10
1.
2.
不
3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。

另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏
感[6]。

4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。

在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在
5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12
时，15min之内会完全降解[7,8]。

6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].
试验方案
主要材料：
1.材料
PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/ml
G-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml
小瓶。

NO
B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O
3.仪器
质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号
KC2007-011)
Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）
Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）
恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）
反相柱：Symmetry C18 5um 300à
高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）
试验过程：
一、缓冲液替换
PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，
稀释
中加入
G-CSF
+DTT
相分离
收样：
SF
+DTT
相分离
集到
之间的
交由崔
文喜冻
干
四、ELLMAN试剂测定自由巯基
由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。

根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：
反应缓冲液：0.10M 磷酸钠+0.001M EDTA ，pH 7.27
温度：25℃
在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.15±0.09*103LM-cm-[9].
1)标准曲线
用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，160 umDTT，
320 umDTT。

用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。

准备两个比色皿。

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收
值调节到0.
412nm final DTNB buffer
参考文献：
1)THEODOREW.T et al.Sensitive Quantitative Analysis of Disulfide Bonds in Polypeptides and Proteins. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 18 1- I88 ( 1984).
2) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for
Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).
3) Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys., 74, 443. (1958).
4) Peter Eyer,et al. Molar absorption coe?cients for the reduced Ellman reagent: reassessment.. Analytical Biochemistry 312 (2003) 224–227
5) for
8)
9)
Anal.。